抽象的な：
細胞骨格は主にマイクロフィラメント、微小管、中間径フィラメントで構成されています。マイクロフィラメントは主にアクチンから構成され、球状の単量体Gアクチンと繊維状のFアクチンの形態で存在します。マイクロフィラメントの集合には、Gアクチンが重合してFアクチンとなる過程が含まれます。テングタケ（Amanita phalloides）から単離された環状ペプチドであるファロイジンは、Fアクチンに高い特異性と親和性で結合するため、細胞のマイクロフィラメントの染色に広く用いられています。
適切なファロイジン製品の選択、正しい固定および透過処理、そして適切な作業濃度とインキュベーション条件は、染色を成功させる上で非常に重要です。ファロイジンを用いて細胞骨格を染色する際によくある失敗例を以下に挙げます。
Q1: サンプルは固定せずに使用できますか?
いいえ。蛍光ファロイジン複合体は、サイズと化学的特性により細胞膜を通過できないため、固定と透過処理が必須となります。
Q2: どの定着剤を使用すればよいですか?
F-アクチン染色には、パラホルムアルデヒド（PFA）が不可欠です。PFAはタンパク質の立体構造を崩すメタノールとは異なり、四次構造を維持します。推奨：4% PFA、室温で10分間。グルタルアルデヒド固定も使用可能です。試験した固定液（例：H1299細胞）の中で、TRITCファロイジンを用いた場合、4% PFAが最も鮮明なマイクロフィラメント構造を示しました。
Q3: 透過処理は必要ですか?
はい。固定後、透過処理が不可欠です。推奨：0.1% Triton X100を室温で5分間浸漬してください。
Q4: 作業濃度とインキュベーション時間はどうですか?
依存するもの:
蛍光標識の種類とストック濃度。未標識ファロイジンのKd値は約36 nMですが、標識ファロイジンは50 nM～20 µMの範囲で変動します。ストック濃度を把握しておきましょう。
細胞の種類によって異なります。通常は80～200 nMが使用されますが、100 nMが一般的です。特定の細胞（例：血小板、歯髄幹細胞、破骨細胞）では5～10 µMが必要になる場合があります。
デフォルトのインキュベーション時間：30分。シグナルが低い場合は調整するか、4℃で一晩インキュベートしてください。
Q5: 蛍光体コンジュゲートはどのように選択すればよいですか?
FITC および TRITC ファロイジンは信頼できる定番です。
マルチプレックス化の場合は、他の抗体と重複しない染料を選択します。
高い輝度と光安定性が必要な場合は、Alexa Fluor または iFluor シリーズをご検討ください。
Q6: ファロイジンは組織切片に使用できますか?
はい、ただし注意点があります。パラフィン包埋溶媒やワックスは結合を妨げる可能性があります。また、脱パラフィン後でも構造変化により染色品質が低下することがよくあります。組織染色の優先順位：細胞 > 凍結切片 > パラフィン。
Q7: 形態学的変異は正常ですか?
はい。F-アクチンの配列は細胞周期に応じて変化します。例えば、有糸分裂期のSwiss 3T3細胞は、間期細胞とは異なるF-アクチンの形態を示します。
Q8: タンパク質や核も染色する場合（例：DAPI を使用）に推奨される染色順序は何ですか？
固定および透過処理後、まず標的タンパク質の免疫染色を行い、次に蛍光ファロイジンでマイクロフィラメントを染色し、最後にDAPIで核を染色します。DAPIとファロイジンはPBS中で干渉なく共インキュベートできます。
適切な試薬と方法を用いることで、染色効率は飛躍的に向上します。皆様の美しい細胞骨格画像がご覧いただけることを願っています。
参考文献:
Luo Guo, Bao Yuxin, Li Jin. 異なる固定液が細胞骨格蛍光染色に及ぼす影響 [J].第三軍医大学誌、2011年、33(7):753755。
Anderson MT、Sherrard K、Horne-Badovinac S. 集団移動する卵胞細胞における基底部に局在するF-アクチンネットワークの最適化された固定とファロイジン染色。Giedt MS、Tootle TL編。Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology 、vol 2626。Humana、ニューヨーク、NY、2023年。
関連製品
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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300 T / 1 mg |
40734 ES 75 / 80 |
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300トン |
40735 ES 75 |
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300トン |
40736 ES 75 |
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300トン |
40737 ES 75 |
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300トン |
40762 ES 75 |
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1mg/5×1mg |
40774 ES03/08 |