HEK293 værtscelle -DNA -restdetektionssæt (3G) Valideringsrapport

HEK293 Værtscelle DNA-restdetektionskit (3G)

Kvalifikationsoversigt (Kat. nr.: 41331ES60)

1. Baggrund

Dataene opsummeret i denne rapport er udført af Yeasen Biotechnology for 'HEK293 Værtscelle DNA-restdetektionskit (3G)' produkt. Opsummeringsdataene er kun til brug for brugerens reference, og brugeren skal verificere værtscelle-resten DNA-metoden ved at bruge deres egne prøver til at bekræfte, at metoden kan opfylde brugerens krav. Alle laboratorier, der bruger dette sæt, anbefales at verificere følgende parametre: Linearitet, Område, Nøjagtighed, Præcision, Kvantificeringsgrænse, Specificitet og Robusthed.

Yeasen Biotechnology kan levere den detaljerede kvalifikationsrapport for dette sæt. Hvis brugeren bruger denne rapport, er det kun egnetheden (som inkluderede Precision, Nøjagtighed og specificitet) skal verificeres.

2. Eksperimentelle materialer og metoder

2.1 HEK293 Værtscelle DNA-restdetektionskit (3G), Leverandør: Yeasen, Kat.nr.: 41331ES60.

2.2 MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit, Leverandør: Yeasen, Kat.nr.: 18461ES60.

2.3 Originaldata: den elektroniske version blev registreret i 'Eksperimentel rapport' underfilen til den overordnede fil 'HEK293 Værtscelle-DNA-restdetektionskit (3G)'.

2.4 Metoder: Materialerne og operationsmetoderne, der blev brugt til eksperimentet, blev som udgangspunkt produceret eller indstillet af Yeasen Biotechnology, som blev vurderet og verificeret i lang tid, kitudvikling og fremstilling er fulgt ISO 13485-systemet.

3. Kvalifikationens indhold og resultater

3.1 Detektionsområde

Sættets lineære område var 30 fg/μL~300 pg/μL med R²≥0,998, og amplifikationseffektiviteten var 90%~110% område med CV <15% for hver koncentrationsanalyse.

Figur 1 HEK293 DNA (3G) qPCR standardkurve

3.2 Nøjagtighed

3.2.1 Recovery

3.2.1.1 Eksperiment til gendannelse af tomprøvespikning

Prøver af HEK293 DNA-standarder ved høje og lave koncentrationer: 300 pg/μL, 3 pg/μL og 30 fg/μL blev henholdsvis fremstillet og analyseret efter ekstraktion ved hjælp af den magnetiske perlemetode til rest-DNA-prøveforbehandlingskit (2 ekstraktionsreplikater blev udført for hver prøve, og 3 assay-gentagelser blev analyseret for hver prøveekstraktioner, og prøverne blev analyseret for hver prøve, og gentagningerne blev udført).

For forskellige koncentrationer af DNA-prøver varierede genfindingerne fra 70% til 130%, og CV'erne var alle <20%.

Prøvetype	Teoretisk koncentration	Udtræk 1 middelværdi	Uddrag 2 middelværdi	Gennemsnitlig koncentration	CV	Genopretning
Blank prøve	/	/	/	/	/	/
Genopretningsprøve 1	300 pg/μL	306,81 pg/μL	279,57 pg/μL	293,82 pg/μL	6,56 %	97,94 %
Genopretningsprøve 2	3 pg/μL	3.11 pg/μL	2,99 pg/μL	3,09 pg/μL	2,75 %	103,00 %
Genopretningsprøve 3	30 fg/μL	31.02 fg/μL	30,63 fg/μL	30,83 fg/μL	0,89 %	102,77 %

Tabel 1 Blank prøve Spiking Recovery

3.2.1.2 Simuleret prøvespikningsgendannelseseksperiment

Prøver af samme koncentration (3 pg/μL HEK293 DNA) blev ekstraheret (2 ekstraktionsreplikater blev udført for hver prøve og 3 assay-replikater blev udført for hver ekstraktion) med 5 forskellige baggrundsopløsninger (højt protein, høj nukleinsyre, høj og lav pH, højt salt), og prøvegenvindinger og CV'er blev analyseret.

DNA-prøvegenfindelser for forskellige baggrundsopløsninger varierede fra 70 % til 130 %, med alle CV'er <20 %.

Prøvetype	Teoretisk koncentration	Udtræk 1 middelværdi	Uddrag 2 middelværdi	Gennemsnitlig koncentration	CV	Genopretning
Grundlæggende prøve	/	/	/	/	/	/
Højt proteinindhold	3 pg/μL	2,65	2,80	2,73	3,80 %	90,87 %
Høj nuklear syre		2,82	2,97	2,90	3,71 %	96,58 %
Højt saltindhold		2,88	2,70	2,79	4,47 %	92,89 %
Høj pH		2,81	2,93	2,87	2,98 %	95,71 %
Lav pH		2.76	2,79	2,77	0,99 %	92,48 %

Tabel 2 Grundlæggende prøve gendannelse af spikes

3.3 Præcision

3.3.1 Gentagelighed

Gentag analysen 10 gange for HEK293 DNA-standarder ved en koncentration på 30 fg/μL med en CV <15%.

Gentagelser	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	Betyde	CV %
Detektionsværdi (fg/μL)	29,51	30.02	30.13	30.16	27,99	31.01	31.05	30,95	31.02	29,86	30.17	3,15 %

Tabel 3 Gentagelighedsresultater

3.3.2 Mellempræcision

Tre forsøgsledere testede uafhængigt HEK293 DNA-standardprøver ved høje og lave koncentrationer: 300 pg/μL, 3 pg/μL og 30 fg/μL, og tre replikater blev udført for hver koncentration, og CV'erne for alle ni opnåede data var <15%.

Exp	Faktisk koncentration Teoretisk koncentration	HEK293 DNA (3G)
		300 pg/uL	3 pg/uL	30 fg/uL
Exp 1	Bestemmelse 1	319,58	3,026	32.02
	Bestemmelse 2	309,76	3.051	37,01
	Bestemmelse 3	309,24	3,067	36,03
Exp 2	Bestemmelse 4	308,34	2.909	29,91
	Bestemmelse 5	308,54	2.9	29,67
	Bestemmelse 6	305,83	2.921	28.85
Exp 3	Bestemmelse 7	299,11	3.035	29,36
	Bestemmelse 8	300,07	2.833	31.14
	Bestemmelse 9	302,03	3,033	33.07
/	Betyde	306,95	2.975	31,90
/	CV %	2,03 %	2,83 %	9,26 %

Tabel 4 Resultater for middelpræcision

3.4 Specificitet

Interferensen af ​​cellulært genomisk DNA, der almindeligvis anvendes i produktionen af ​​biologiske lægemidler, blev vurderet for interferens med HEK293 DNA-detektionsreagenser, og interferensgruppen overlappede med kontrolgruppen, og der blev ikke set nogen interferens (figuren nedenfor viser, i rækkefølge, interferensdataene for CHO, E.coli og Pichia Pastoris genomiske DNA'er med HEK293-detektionsreagenser).

Figur 2 Interferenseksperimentresultater

3.5 Kvantificeringsgrænse

HEK293 DNA blev påvist ved 30 fg/μL, 20 fg/μL, 10 fg/μL og 5 fg/μL, med 10 replikater for hver koncentration. Resultaterne viste, at CV var <20 % ved koncentrationer på 10 fg/μL og derover. Det vil sige, at grænsen for kvantificering af HEK293-værtscelle-DNA-restdetektionskit (3G) var 10 fg/μL.

Gentagelser Test vare	HEK293 DNA (3G) (fg/μL)
	Mængde	Genberegningsforhold %
1	11.04	110,40 %
2	9,97	99,70 %
3	11.12	111,20 %
4	11.07	110,70 %
5	11.21	112,10 %
6	9,93	99,30 %
7	10.25	102,50 %
8	10.16	101,60 %
9	10.08	100,80 %
10	10.11	101,10 %
Betyde	10.49	/
CV %	5,14 %	/

Figur 3 10fg/μL HEK293 DNA (3G) qPCR-testresultat

3.6 Robusthed

Dette sæt er blevet testet og er velegnet til, men ikke begrænset til, følgende instrumenter:

Sælger	Instrumentmodeller	Forstærkningseffektivitet	R2	Kvantificeringsgrænse (fg/μL)	CV %
Termo	ABI 7500	102,84 %	1	10	7 %
Termo	ABI QuantStudio5	104,70 %	0,999	10	9 %
Shanghai Hongshi	SLAN	101,46 %	0,999	10	8 %

Tabel 5 Instrumentets egnethedstestresultater

3.7 Stabilitet

3.7.1 Fryse-tø stabilitet

HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) blev testet ved gentagen frysning og optøning 10 gange, og sættets ydeevne blev ikke påvirket.

Testindikatorer Fryse-tø-tider	Parameter	T0 tid	Frys-tø 10 gange
Standard kurveparameter	Forstærkningseffektivitet	99,34 %	100,78 %
	R2	1	1
Kvantificeringsgrænse (30 fg/μL)	CV	11 %	7 %

Tabel 6 Fryse-tø stabilitet resultatanalyse

3.7.2 Accelereret stabilitet

HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) blev opbevaret ved 2~8°C i henholdsvis 30 dage og 37°C i 14 dage. Ingen af ​​sættets ydeevne blev påvirket.

Testindikatorer Accelerationstemperatur og tid	Parameter	T0 tid	37℃ 7 dage	37℃ 14 dage
Standard kurveparameter	Forstærkningseffektivitet	103,83 %	101,58 %	100,47 %
	R2	0,999	1	1
Kvantificeringsgrænse (30 fg/μL)	CV %	8 %	5 %	5 %

Tabel 7 Accelereret stabilitetsresultatanalyse

3.8 Grænse for blank

Ingen skabelonkontrol (NTC) var en skabelonfortynding med 96 gentagelser af CT-værdier >32 (plus ROX-kalibreringstærskellinje sat til 0,06).

Figur 4 NTC-eksperimentresultater

4. 4.Reference

4.1 Chinese Pharmacopoeia Commission (ChPC). Farmakopé for Folkerepublikken Kina (Vol Ⅲ) [S]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, s. 542-543, 2020.

4.2 NMPA, 2007: Generelle principper for teknisk gennemgang af analysemetodevalidering til kvalitetskontrol af biologiske produkter.

4.3 ICH(2022)《Analytisk metodevalidering Q2》, udkast til version.

Bestillingsinformation