T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti -10623es
Yakınlaştırmak için görüntüyü yuvarlayın Yakınlaştırmak için resme tıklayın
T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti -10623es
T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti -10623es
T7 Yüksek Verimli RNA Sentezi Kiti transkripsiyon reaksiyon sistemini optimize eder. Kit, şablon olarak T7 promotör dizisine sahip doğrusal çift sarmallı DNA olan T7 RNA polimerazını, promotörün aşağı akışındaki DNA dizisini kontrol etmek için substrat olarak NTP'leri kullanarak tek sarmallı RNA'yı verimli bir şekilde sentezleyebilir. Transkripsiyon sırasında, biyotin veya boya etiketli RNA hazırlamak için substrata modifiye nükleotidler eklenebilir. Bu kit uzun transkriptleri ve kısa transkriptleri sentezleyebilir, RNA 1 μg DNA şablon girişiyle 100-200 μg üretilebilir. Transkripsiyonla sentezlenen RNA, RNA yapısı ve işlevi araştırması, RNase koruması, prob hibridizasyonu, RNAi, mikroenjeksiyon ve...

Frequently Bought Together

T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti -10623es

YeasenSKU: 10623ES10
Boyut: 10 T
Fiyat:
$35.00
Stoklamak:
Stokta var

T7 Yüksek Verimli RNA Sentezi Kiti transkripsiyon reaksiyon sistemini optimize eder. Kit, şablon olarak T7 promotör dizisine sahip doğrusal çift sarmallı DNA olan T7 RNA polimerazını, promotörün aşağı akışındaki DNA dizisini kontrol etmek için substrat olarak NTP'leri kullanarak tek sarmallı RNA'yı verimli bir şekilde sentezleyebilir. Transkripsiyon sırasında, biyotin veya boya etiketli RNA hazırlamak için substrata modifiye nükleotidler eklenebilir.

Bu kit uzun transkriptleri ve kısa transkriptleri sentezleyebilir, RNA 1 μg DNA şablon girişiyle 100-200 μg üretilebilir. Transkripsiyonla sentezlenen RNA, RNA yapısı ve işlevi araştırması, RNase koruması, prob hibridizasyonu, RNAi, mikroenjeksiyon ve in vitro gibi çeşitli alt akış uygulamaları için kullanılabilir. çeviri.

Şekil 1: In vitro RNA transkripsiyon süreci

Özellik

  • 1 μg kontrol şablonundan reaksiyon başına 180 μg'a kadar RNA
  • IVT prosesi için optimize edilmiş reaksiyon sistemi
  • dsRNA üretimini azaltın
  • Daha yüksek RNA bütünlüğü ve saflığı

Başvuru

  • In vitro RNA sentezi

Bileşenler

Bileşenler No. İsim 10623ES50 (50 T) 10623ES60 (100 T) 10623ES70 (500 T)
10623-A T7 RNA Polimeraz Karışımı 100 μL 200 μL 1 ml
10623-B 10×Transkripsiyon Tamponu 100 μL 200 μL 1 ml
10623-C ATP (100mM) 100 μL 200 μL 1 ml
10623-D CTP (100mM) 100 μL 200 μL 1 ml
10623-E GTP (100mM) 100 μL 200 μL 1 ml
10623-F UTP (100mM) 100 μL 200 μL 1 ml
10623-G Kontrol DNA Şablonu (500ng/μL) 10 μL 20 μL 100 μL

Nakliye ve Depolama

Kuru buz taşımacılığı. -15℃ ~ -25℃'de saklayın, iki yıl geçerlidir.

Rakamlar

Şekil 1. Standart RNA, T7 RNA sentez kiti kullanılarak in vitro sentezlendi.

Reaksiyon 37℃'de 2 saat boyunca bir PCR cihazında inkübe edildi ve ardından manyetik boncuklarla (Cat#12602) saflaştırıldı. Verim sonucu Şekil 1'de gösterildiği gibi NanoDrop spektrofotometresi ile analiz edildi.

Şekil 2. Elektroforetogramda (Şekil 2A), kapiler elektroforez diyagramında (Şekil 2B) ve kromatogramda (Şekil 2C) sırasıyla T7 kiti ile farklı RNA uzunluklarının transkripsiyon gösterimi

Şekil 3. İn vitro kapalı RNA sentezi.

Reaksiyon 2 saat boyunca 37℃'de PCR cihazında inkübe edildi ve ardından manyetik boncuklarla (Cat#12602) saflaştırıldı. Verim sonucu Şekil 3A'da gösterildiği gibi NanoDrop spektrofotometresi ile ölçüldü. Bütünlük sonucu Şekil 3B'de gösterildiği gibi kapiler elektroforez ile analiz edildi.

Belgeler:
Sıkça Sorulan Sorular:

1. Düşük transkript verimi

Şablonun kalitesi verimle yakından ilişkilidir. Deney grubunun verimi kontrol grubundan önemli ölçüde düşükse, olası nedenler şunlardır:

① deneysel şablon inhibitör bileşenleri içerir;

② Şablonda bir sorun var.

Öneriler:

① Şablonu yeniden arındırın;

② Şablonun niceliğini ve bütünlüğünü belirleyin;

③ Tepkime süresini uzatın;

④ Şablon girişinin miktarını artırın;

⑤ Diğer promotörleri ve RNA polimerazları deneyin.

2. Kısa transkriptlerin düşük verimi

Kısa bir transkripsiyon başlatma parçası reaksiyonu inhibe edecektir. Transkripsiyon ürünü 100 nt'den az olduğunda, reaksiyon süresini 4-8 saate uzatmak veya şablon miktarını 2 μg'a çıkarmak RNA verimini artıracaktır.

3. RNA transkripsiyon uzunluğu beklenenden daha uzundur

Elektroforez sonucunda ürün bandının beklenenden daha büyük olduğu görülürse olası nedenler şunlardır:

①Plazmit şablonu tamamen doğrusallaştırılmamış olabilir;

②Duyusal ipliğin 3' ucu belirgin bir yapıya sahiptir;

③RNA'nın tamamen denatüre olmamış ikincil bir yapısı vardır.

Öneriler:

①Şablonun tamamen doğrusallaştırılmış olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse ek doğrusallaştırma yapın;

②3' çıkıntılarını önlemek için uygun bir restriksiyon enzimi seçin veya devam etmeden önce transkripsiyonu tamamlamak için Klenow Fragment/T4 DNA polimerazını kullanın;

③RNA ürünlerini tespit etmek için denatüre jel kullanın.

4. RNA transkripsiyon uzunluğu beklenenden daha azdır

Elektroforez sonucunda ürün bandının beklenen boyuttan daha küçük olduğu görülürse olası nedenler şunlardır:

①Şablon, T7 RNA polimerazına benzer bir sonlandırma dizisi içerir;

②Şablondaki GC içeriği yüksektir.

Öneriler:

①Tepkime sıcaklığını düşürün (örneğin, 30°C). Bazen sıcaklığı düşürmek transkripsiyon uzunluğunu artırabilir, ancak verimi azaltacaktır. Veya transkripsiyon için farklı RNA polimerazları deneyin;

②Şablon GC içeriği yüksekse, 42℃ kullanın transkript etmek veya verimi ve transkripsiyon uzunluğunu artırmak için SSB eklemek.

5. Transkripsiyon ürünlerinin elektroforez kuyruğu

Elektroforez sırasında kuyruklanma olayı meydana gelir.

Olası nedenler:

①Deneysel işlem sırasında RNase ile kirlenmiştir;

②RNase ile kontamine DNA şablonu.

Öneriler:

①RNase içermeyen pipet uçları ve EP tüpleri kullanın, tek kullanımlık lateks eldiven ve maske takın ve tüm reaktifler RNase içermeyen H2O ile hazırlanmalıdır.

②Şablon DNA’yı tekrar saflaştırın.

Alıntılar ve Referanslar:

[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, ve diğerleri.Nosema bombycis mikroRNA benzeri RNA 8 (Nb-milR8), Konağı Bombyx mori'de BmPEX16 Gen Ekspresyonunu Düzenleyerek Mantar Patojenitesini Artırır. Mikrobiyoloji Spektr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)

[2] Wang X, Tang S, Ye S, ve diğerleri. Üçlü zincir yer değiştirme amplifikasyon kaskadı ile dolaşan miR-195-5p'nin ultra hassas kantifikasyonu. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)

Storage

Dry ice transportation. Store at -15℃ ~ -25℃, valid for two years.

FAQ

The size is 1142 base pairs.
The polyA tail is introduced during the design of the template, while the addition of the cap is done separately.
1. Increase the input ratio of NTP and its analogues; 2. Reasonable application of additives; 3. The reaction temperature can be set at 40 degrees.
The optimization of the IVT system can be achieved by adjusting the template, the amount of T7 enzyme used, and if it is co-transcription with cap addition, the ratio between the cap and NTP can be considered; for enzymatic cap addition, the conditions can be optimized in terms of the dosage of the cap-adding enzyme, 2-O-methyltransferase, and SAM. Regarding the template, apart from the requirement of complete linearization, there is another point, which is sequence design. For example, in the 5'UTR region, pay attention to uAUG and Kozak sequence; for CDS, consider the codon preference, GC3 content, and dinucleotide preference, etc.; 3'UTR: RBP and miRNA binding sites: and another point is the secondary structure of RNA. The stable secondary structure of the 5'UTR pre-sequence will reduce the expression of mRNA; the stable secondary structure of 3'UTR will increase the stability of mRNA and promote the expression of the encoded protein. For the recommended IVT system and more detailed tips, please refer to the mRNA in vitro synthesis experiment manual of Vivian Biotechnology.
When scaling up the 20uL system proportionally to 10mL, the yield should be approximately the same. Usually, we directly scale up from 20uL to 50mL, and the yield is generally at the level of 100ug/20uL. For the 50mL volume, we also use centrifuge tubes and a metal bath for measurement. For the 10mL volume, the amplification effect is generally better. In such cases, it is generally recommended to fine-tune the final concentrations of the enzyme and NTP before trying again.
Regarding the re-submissions from our other clients, based on the CE results measured using Qsep100, the ideal situation is that the CE integrity can reach 88% to 92%; of course, achieving this level usually requires a series of optimizations.
The average yield is between 120-220 ug/ul (the yield is highly dependent on the sequence design). In the co-transcription method, the mRNA yield is 8 g/L. With process optimization, the yield will increase. Currently, the quality parameters of the available processes include observing the fluorescence value of GFP and measuring the cap addition rate using LC-MS.
We can also conduct RNA electrophoresis. The main purpose is to briefly assess the purity of the products and check for any obvious aggregates, etc. If we are looking at the size of the RNA, during the electrophoresis process, we usually add a sample of a clearly defined RNA size as a reference.
Currently, the detection of the template mainly includes items such as sequence integrity, endotoxin, and residual host nucleic acids. There is no clear detection method for RNase yet; or you can refer to the detection method for residual RNase in our enzyme products, which is relatively simple and reliable.
There are several possible reasons for the generation of ds during the IVT process, mainly:
The T7 pol enzyme will use the product RNA as a template and continue to extend the RNA at its 3' end. The extended sequence will form complementary pairing with the 3' end sequence of the original RNA molecule, thereby creating a hairpin structure.
The T7 pol enzyme can use RNA as a template to replicate RNA molecules, and synthesize the complementary strand.
(At present, there is no effective method for removing dsRNA. However, there is a patent report suggesting that a fiber column (sigma) could be tried.)
The suggestions regarding optimizing the IVT system and adjusting the reaction conditions to inhibit dsRNA mainly include the following points:
1. Reduce the concentration of magnesium ions; however, reducing the concentration of magnesium ions will also lead to a decrease in the production of RNA, and a balance point needs to be reached.
2. Increase the reaction temperature of IVT to 50-56℃. This temperature can effectively reduce the content of dsRNA in the product; however, the requirements for equipment for high-temperature reactions will vary, and it may also increase the cost.
3. In the IVT reaction system, certain dispersants such as urea and formamide are added; our process research team has also conducted some experiments on this route, which can achieve the effect of inhibiting dsRNA. However, whether it is suitable for process scaling-up still needs further research.
Internal research has studied this precipitation. It is a polymer composed of magnesium ions, RNA, sodium ions, and magnesium pyrophosphate. There is a coagulation effect, and the aggregates keep growing in size (similar gel-like, flocculent, or particulate precipitations all follow a similar principle). The effects of adding water and adding EDTA are similar, which also supports this statement. Reasons: 1. If the concentration of Mg ions is too high, it will aggregate with pyrophosphate to form magnesium pyrophosphate precipitation. However, it has a coagulation effect, continuously encapsulating nucleic acids to form a gel-like substance, resulting in a decrease in yield. 2. A high RNA production level will also cause precipitation.
This kind of precipitation occurs by chance and is also closely related to the sequence design.
Solution: (1) Reduce the concentration of magnesium ions, but this will result in a decrease in yield. The amount of T7 enzyme needs to be increased and the reaction time (from 2 hours to 3-4 hours) needs to be extended; (2) The form of NTP (the presence of magnesium ions at a high concentration, such as 46 mM, does not select NTP, but when the magnesium ion concentration decreases, the yield of NTP (Tris salt form) does not change much, and the yield of the triNa form of NTP decreases significantly.
You could consider WAVE, Haodao Fu reaction vessels, and Sartorius. The main thing is to find bags that are compatible with the existing IVT system. For the stirring tank, the rotational speed of the propeller also needs to be optimized based on the actual situation, as it is related to the type and size of the blades. It is recommended to consult the equipment manufacturer.
In industry, the most commonly used method for enzymatic cap addition is to treat IVT products with vaccinia virus cap-adding enzyme, which can modify them into Cap 0 mRNA. The Cap 0 structure can be further modified into Cap 1 (m7GpppmN) under the action of 2'O-methyltransferase. With enzymatic cap addition, the cap addition efficiency can reach over 95%. The co-transcription cap addition method is simple to operate, but because GTP competes with the cap dimer, the cap addition rate of this method is a little lower; both methods have their own advantages and disadvantages.
Currently, our system uses a 20-ul reaction volume. The output of in vitro transcription is 100-200 ug. The internal amplification system with a 10 ml volume can reach 50 mg - 100 mg.
It is recommended that the entire reaction time be between 2 and 3 hours. Our company has verified a maximum reaction time of 3 hours, and our cooperative clients have also verified a reaction time of 4 hours, and the results were normal.
No related services are provided. Currently, the main reference for the COVID-19 vaccine is still the publicly available vaccine sequences from external sources, namely BioNtech and Moderna. The main original sequences are generally reliable, except for the incomplete polyA tail; the earlier COVID-19 vaccines developed in China are mostly based on the RBD protein sequences. We haven't obtained the specific sequences for this part; basically, these are the core technologies of each research team.
The capillary column used for adding the cap is from the Agilent series (6230B TOF), while the tailing column used is from Thermo's QE or Waters' Rda.
This reagent kit does not contain the component for poly A tail. In the template preparation stage, the A tail can be attached to the plasmid, and the length is usually between 20 and 200.
Any power rating above 13000 rpm is acceptable.
The precipitate is spermidine. This is a normal phenomenon and it can be dissolved by hand.

Citations

Documents

Manual
10623_Manual_HB230115_EN.pdf
MSDS
10623-MSDS-HB260713.pdf
MSDS-10623-A-T7_RNA_Polymerase_Mix-HB221014.pdf
MSDS-10623-B-10x_Transcription_Buffer-HB221014.pdf
MSDS-10623-C-ATP_100_mM_-HB221014.pdf
MSDS-10623-D-CTP_100_mM_-HB221014.pdf
MSDS-10623-E-GTP_100_mM_-HB221014.pdf
MSDS-10623-F-UTP_100_mM_-HB221014.pdf
MSDS-10623-G-DNA_template-HB221014.pdf

Applications

Ayrıca sevebilirsiniz

Sorgu

SSS

Ürün yalnızca araştırma amaçlıdır ve insanlarda veya hayvanlarda terapötik veya teşhis amaçlı kullanım için tasarlanmamıştır. Ürünler ve içerikler, Yeasen Biotechnology'nin sahip olduğu patentler, ticari markalar ve telif haklarıyla korunmaktadır. Ticari marka sembolleri, tüm bölgelerde tescilli olmayıp, menşe ülkesini gösterir.

Bazı uygulamalar üçüncü tarafların ek fikri mülkiyet haklarına ihtiyaç duyabilir.

Yeasen, araştırmalarımızın güvenlik ve etik standartları sağlarken kritik soruları ele alması gerektiğine inanarak etik bilime kendini adamıştır.