I. Western Blot Prensipleri
Western Blot (WB) veya protein immünoblotlama, antijen-antikor etkileşimlerine dayalı spesifik proteinleri tespit etmek için klasik bir tekniktir ve moleküler biyoloji, immünoloji ve ilgili alanlarda yaygın olarak kullanılır. Temel adımları şunlardır:
- Protein Ayrımı:
- SDS-PAGE denatüre proteinleri moleküler ağırlıklarına göre ayırır.
- SDS, proteinleri homojen negatif yükle kaplayarak yapısal etkileri ortadan kaldırır.
- Membran Transferi:
- Proteinler jelden bir membrana (örneğin PVDF veya nitroselüloz) aktarılır.
- Antikor Tespiti:
- Birincil antikorlar hedef proteine spesifik olarak bağlanır, bunu kemilüminesans gibi saptanabilir bir sinyal üreten enzim konjugeli ikincil antikorlar (örneğin HRP) izler.
II. Standart Western Blot İş Akışı
| Adım | Temel Prosedürler | Önerilen Reaktifler (Yeasen Ürünleri) |
| 1. Örnek Hazırlama | Proteinleri RIPA lizis tamponuyla çıkarın; proteazları inhibe etmek için PMSF ekleyin etkinlik. | RIPA Lizis Tampon Serisi, PMSF |
| 2. Protein Miktar Tayini | BCA yöntemini kullanın (Kedi#20200ES) miktar tayini için; standart seyreltme tamponunu numune tamponuyla eşleştirin. | BCA Miktar Tayini Kitleri (Kedi#20200ES/20201TS) |
| 3. SDS-PAGE Elektroforezi | Hazır jelleri kullanın, boya jel tabanına ulaşana kadar 150 V'da çalıştırın. | Önceden Döküm Jeller, SDS-PAGE Yükleme Tamponu |
| 4. Membran Transferi ve Blokajı | PVDF membranını aktive edin (Kedi #36125ES) 1 dakika boyunca metanolde bekletilerek; 60 dakika boyunca buz banyosunda 300 mA'de transfer edilerek; 1 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) bloke edilerek veya hızlı blokaj solüsyonu kullanılarak (Kedi#36122ES) 10 dk. | Türkçecevap Tamponu, PVDF Membran Serisi |
| 5. Antikor İnkübasyonu | Birincil antikorla 4°C'de bir gece inkübe edin; ikincil antikoru oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin; TBST ile 3 kez iyice yıkayın. | Antikor Seyreltici |
| 6.Protein Tespiti | ECL ile geliştirin (Kedi#36208ES). | ECL Kemilüminesans Serisi |
Şekil 1: Western Blot İş Akışı
III. Ortak Sorunlar ve Çözümleri
| Sorun | Olası Nedenler | Çözümler |
| Yüksek Arka Plan  | Eksik blokaj | Taze blokaj solüsyonu kullanın ve blokaj süresini uzatın. |
| Yetersiz yıkama | Spesifik olmayan bağlanmaları gidermek için yıkama sıklığını ve süresini artırın. | |
| Aşırı birincil antikor konsantrasyonu | Antikoru uygun konsantrasyona kadar seyreltin. | |
| Örnek kalite sorunları | Numunenin saflığını ve kalitesini kontrol edin; taze numuneler kullanın. | |
| Membran kurutma | İnkübasyon adımları boyunca membranın nemli kalmasını sağlayın; reaksiyon solüsyonlarıyla tam temas sağlayın. | |
| Zayıf veya Sinyal Yok  | Eksik transfer | Transfer verimliliğini doğrulayın ve gerektiğinde zamanı ayarlayın. |
| Aktifleştirilmemiş PVDF membranı | PVDF'yi tampona aktarmadan önce aktive etmek için metanolde bekletin. | |
| Hedef türlerle birincil antikor uyumsuzluğu | Veri sayfasını kontrol edin, immünogen ve protein dizilerini karşılaştırın ve bir Yaygın olarak kullanılan pozitif kontrol (örneğin memeli hücrelerindeki β-aktin). | |
| Birincil ve ikincil antikor uyumsuzluğu | İkincil antikorun, birincil antikorun konak türüyle uyumlu olduğundan emin olun. | |
| Yetersiz antikor bağlanması | Antikor konsantrasyonunu artırın ve inkübasyonu 4°C'ye (örneğin bir gece) uzatın. | |
| Düşük antijen seviyeleri | Her şerit için en az 20-30 μg protein yükleyin; proteaz inhibitörleri ve pozitif kontrol kullanın. | |
| Düşük hedef protein ifadesi | Örnekteki ifadeyi literatür/veri tabanı aracılığıyla doğrulayın; örneği yoğunlaştırın veya yüksek ifadeli bir kontrol kullanın. | |
| Belirli Olmayan Bantlar/Birden Fazla Bant  | Aşırı pasajlanmış hücre hatları protein profillerini değiştiriyor | Düşük geçişli hücreleri (<15 geçiş) kullanın ve erken geçişli stoklarla paralel kontroller çalıştırın. |
| Protein bozulması | Lizis tamponuna proteaz inhibitörleri ekleyin; -80°C'de saklayın, dondurma-çözme işleminden kaçının, taze örnekler kullanın. | |
| Çeviri sonrası modifikasyonlar | Bant boyutunu etkileyen değişiklikler (örneğin ubikitinasyon, glikozilasyon) için literatürü kontrol edin. | |
| Çoklu ekleme çeşitleri | Ekleme varyantlarını literatür veya veri tabanları aracılığıyla doğrulayın. | |
| Protein dimerleri/multimerleri | SDS yükleme tamponuna taze β-merkaptoetanol veya DTT ekleyin. | |
| Ekzojen protein kontaminasyonu | Ekzojen proteinleri kontrol edin; gerekirse hücre hattını değiştirin. | |
| Aşırı örnek yüklemesi | Hedef ifadeye göre yüklemeyi (20-30 μg) gradyan testi yoluyla optimize edin. | |
| Multimer oluşumu | Multimerleri ayırmak için numuneleri 10 dakika kaynatın | |
| Yüksek birincil antikor konsantrasyonu | Ekstra bantlardan kaçınmak için konsantrasyonu ve/veya inkübasyon süresini azaltın. | |
| Yüksek sekonder antikor konsantrasyonu | Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için konsantrasyonu düşürün ve yalnızca ikincil bir kontrol ekleyin. | |
| Bildirilmeyen proteinlerin veya aile üyelerinin tespiti | Literatürü veya BLAST'ı inceleyin; önerilen hücre hatlarını/dokuları kullanın. | |
| Doğrulanırsa yeni bir protein keşfetmiş olabilirsiniz! | ||
| Gülümseyen Gruplar  | Hızlı geçiş, yüksek tampon sıcaklığı, aşırı yükleme, düşük tampon | Yavaş göç, tamponu önceden soğutun, protein yükünü azaltın, tamponun kuyuları tamamen kapladığından emin olun. |
| Kaşlarını çatan bantlar  | Cihaz sorunları (örneğin, jelin altında kabarcıklar) | Kabarcıkları ortadan kaldırmak ve jelin eşit polimerizasyonunu sağlamak için kurulumu ayarlayın. |
| Kuyruk Bantları  | Zayıf örnek çözünürlüğü, bozulma, tekrar kullanılan tampon | Örnekleri iyice karıştırın, taze örnekler kullanın, taze çalışma tamponu hazırlayın. |
| Dambıl Şeklindeki Bantlar  | Düzensiz jel polimerizasyon, saf olmayan numuneler | Tekdüzelik için jeli yeniden dökün; kullanmadan önce numuneleri santrifüjleyin. |
| Bant Bulaşması  | Aşırı yükleme, düşük jel kalitesi | Numune hacmini azaltın, jel hazırlığını iyileştirin. |
| Kabarcık İzleri  | Transfer sırasında hava sıkıştı | Transfer sandviçi birleştirirken kabarcıkları çıkarın. |
| Düzensiz Siyah Noktalar  | Çözünmemiş blokaj solüsyonu, düzensiz antikor dağılımı | Blokaj solüsyonunu tamamen çözün, TBST ile 3 kez yıkayın, inkübasyon sırasında çalkalayın. |
| Beyaz Lekeler  | Yüksek antikor konsantrasyonu tüketen substrat | Daha düşük birincil/ikincil antikor konsantrasyonları. |
Ⅳ.Ürün Seçimi ve Optimizasyon Araçları
Yeasen, iş akışınızı kolaylaştırmak için kapsamlı bir reaktif paketi sunar
İlgili Ürünler:
| Prosedürler | Kedi. No. | Ürün Adı | Özellikler |
| Örnek Hazırlama | 20101ES | RIPA lizis tamponu (güçlü) | 100 ml |
| 20115ES | RIPA Lizis Tamponu (Orta) | 100 ml | |
| 20114TS | RIPA lizis tamponu (Zayıf) | 100 ml | |
| 20118ES | WB/IP Analizleri için Lizis Tamponu | 100 ml | |
| BCA Protein Miktar Tayini Kiti (Gelişmiş) | 500T/2500T/5000T | ||
| BCA Protein Miktar Tayini Kiti（Kullanıma hazır） | 500 Ton | ||
| SDS-PAGE Elektroforezi | Altın Bant Artı 3 Renkli Düzenli Aralık Protein İşaretleyicisi (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| GoldBand™ 3 Renkli Yüksek Aralıklı Protein İşaretleyici (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | SDS-PAGE Jel Hazırlama Kiti | 1 kit (30~50 jel)/ 1 kit (150~250 jel) | |
| PAGE Jel Hızlı Hazırlık Kiti | Konsantrasyonlar: %8、%10、%12,5、%15 | ||
| 36259ES-36280ES | Prekast Protein Plus Jel | Konsantrasyonlar: %8, %10, %12, %4-12, %4-20 Yükleme Kuyusu Seçenekleri: 10 kuyu, 12 kuyu, 15 kuyu | |
|
Membran Transferi ve Blokajı | 0,45 μm PVDF Membran (1 rulo, 30cm×3 m) | 1 rulo | |
| 0,22 μm PVDF Membran (1 rulo, 30cm×3 m) | 1 rulo | ||
| Antikor İnkübasyonu | 36206ES | WB için Birincil ve İkincil Antikor Seyreltici | 100 mL/500 mL |
|
Protein Tespiti | Süper ECL Algılama Reaktifi | 100 mL/500 mL | |
| Geliştirilmiş ECL Kemilüminesans Substrat Kiti | 100 mL/500 mL |
V.Destek Nasıl Alınır
Kişiselleştirilmiş sorun giderme veya protokol optimizasyonu için:
- Ziyaret etmek: Yeasen Western Blot Ürün Sayfası
- E-posta: info@yeasenbio.com
Başarı İçin Altın Kural: Standartlaştırılmış prosedürler + yüksek kaliteli reaktifler + adım adım doğrulama = tekrarlanabilir WB sonuçları!