dNTP, PCR'de kullanılan ve büyüyen bir DNA ipliğini çoğaltabilen desenli ribonükleotid trifosfat anlamına gelir. Başka bir deyişle, PCR'deki dNTP'ler hidrojen bağları aracılığıyla tamamlayıcı DNA ipliklerine yerleşir ve büyüyen DNA iplikleri Taq DNA polimerazı yardımıyla genişletilir. PCR'de dNTP'nin özel uygulaması nedir? Yüksek saflıktaki dNTP'lerin sahip olması gereken özellikler nelerdir?

1. dNTP’ler nelerdir?
2. PCR’da dNTP konsantrasyonu nedir?
3. Yüksek saflıktaki dNTP’nin sahip olması gereken özellikler nelerdir?
4. İlgili ürünler ve performans

1. dNTP’ler nelerdir?

Deoksinükleozid trifosfatlar (dNTP'ler), riboz, bir baz ve bir fosfattan oluşan bir nükleotid zinciri olan deoksiriboz içeren nükleozid trifosfatlardır. dNTP'ler, nükleik asit moleküllerinin temel yapı taşlarıdır ve bu nedenle PCR karışımlarının gerekli bileşenleridir, çünkü bunlar olmadan yeni bir çoğaltılmış DNA üretilemez. Bir DNA dizisini oluşturan dört ayrı deoksinükleotid, deoksiadenozin trifosfat (dATP), deoksitimidin trifosfat (dTTP), deoksisitidin trifosfat (dCTP) ve deoksiguanozin trifosfat (dGTP). Ek olarak, dNTP'lerin kalitesi PCR, cDNA sentezi, qPCR, dizileme, klonlama ve DNA etiketleme gibi birçok prosedürün başarısı için de kritik öneme sahiptir.

Her biri farklı bir DNA bazı kullanan dört tip dNTP veya deoksinükleotid trifosfat vardır: adenin (dATP), sitozin (dCTP), guanin (dGTP) ve timin (dTTP). Uzatma fazında dNTP kullanmak, yapı taşları gibi DNA'ya girmeye ve onu ikiye katlamaya hazır tek bazlar sağlar. Tekniğin amacı yeni DNA sentezlemek olduğundan, dNTP tek bir tarafın şablonunu kullanarak "fermuar açılmış" ipliğe nükleotidler sağlar. Bu, tek bir DNA ipliğini ikiye dönüştürür ve reaktifler son tutma aşamasına kadar mevcut olduğu sürece üssel olarak devam edebilir.

2. PCR’da dNTP konsantrasyonu nedir?

PCR, ilgi duyulan bir DNA parçasının jel elektroforezi altında görüntülenebilmesi için birden fazla kopyasını oluşturmak için gerçekleştirilen bir in vitro DNA sentezi tekniğidir. PCR'nin amacı, DNA dizilemesinde veya DNA mikrodizilerinde çeşitli alt akış uygulamaları için çok sayıda DNA kopyası yapmaktır. Bileşenleri arasında DNA şablonları, primerler, tamponlar ve Taq DNA polimeraz dNTP bulunur. PCR mekanizmasını anlamak için kullanılan bileşenlerin önemini ve ilkesini anlamak gerekir. dNTP, PCR'nin temel bileşenlerinden biridir. PCR'deki dNTP'lerin işlevi, Taq DNA polimerazının yardımıyla büyüyen DNA ipliğini çoğaltmak ve hidrojen bağı yoluyla tamamlayıcı DNA ipliğiyle birleşmektir.

PCR işlemi sıcaklığa bağlı üç adıma ayrılır: denatürasyon, tavlama ve uzatma. Denatürasyon adımı sırasında, çift sarmallı DNA tek sarmallı DNA'ya denatüre edilir. Tavlama adımı sırasında, primerler tamamlayıcı dizilerinin tam konumuna bağlanır ve uzatma adımı sırasında, Taq DNA polimeraz büyüyen DNA ipliğine dNTP'ler ekler. Teller açıldığında ve primerler tek sarmallı DNA'ya bağlandığında, Taq DNA polimeraz katalitik aktivitesine başlar. Bir sonraki adımda, tam tamamlayıcı nükleotid mevcutsa P-DNA kompleksine daha az afiniteyle bağlanan dNTP'lerin eklenmesi başlar. Taq DNA polimeraz tutunduktan kısa bir süre sonra, tamamlayıcı bazlar ve dNTP'ler arasında hidrojen bağı etkileşimleri meydana gelir. Burada, başlangıçta tüm nükleotid değil, dNTP'deki baz (azot bazı) bağlanıp bağlanmamaya karar verir.İlk olarak, şablon ssDNA'da tamamlayıcı bir baz (T için A, C için G) bulursa, aralarında bir hidrojen bağı oluşturacaktır. C ve G arasında üç hidrojen bağı ve A ve T arasında iki hidrojen bağı yapılır. Hidrojen bağı oluştuktan sonra, Taq DNA polimeraz, bir fosfodiester bağı oluşturarak büyüyen DNA ipliğine dNTP'nin dahil edilmesine uyum sağlar. Şimdi fosfodiester bağı oluştuktan sonra, Taq DNA polimeraz yeni dNTP'ler eklemede bir adım daha ileri gider. Primerin 3'OH'si ile dNTP'nin 5'P'si arasında bir fosfodiester bağı oluşur. Hidrojen bağı oluştuktan sonra, Taq DNA polimeraz, dNTP'lerin trifosfatlarından gama ve beta-fosfatları çıkararak reaksiyonu katalize eder. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, iki pirofosfat (PPi) serbest bırakılır. Ancak PCR reaksiyonlarında dNTP'lerin ve Taq polimeraz etkileşiminin kesin kinetiği bilinmemektedir.

Bu dört nükleotid, tipik olarak PCR reaksiyonuna optimum baz katılımı için ekimolar miktarlarda eklenir. Bununla birlikte, PCR ile rastgele mutagenezi gibi belirli durumlarda, düzeltme okumayan bir DNA polimerazı tarafından daha yüksek derecede yanlış katılımı teşvik etmek için dengesiz dNTP konsantrasyonları kasıtlı olarak sağlanır. Minimum dNTP konsantrasyonunu belirleyen faktör, hedef dizinin DNA uzunluğu ve bileşimidir. PCR reaksiyonunda, dNTP genellikle 50-200 μmol/L'dir. Son dNTP konsantrasyonu 50 mmol/L'den fazla olduğunda, Taq DNA polimerazının aktivitesini inhibe edebilir. Dört dNTP'nin konsantrasyonları, bir dNTP eksikliğinden kaynaklanan amplifikasyon sırasında yanlış katılımı azaltmak için eşit olmalıdır.

Yaygın PCR uygulamalarında, her dNTP'nin önerilen son konsantrasyonu genellikle 0,2 mM'dir. Bazı durumlarda, özellikle yüksek Mg konsantrasyonlarının varlığında daha yüksek konsantrasyonlar yardımcı olabilir²⁺, Mg olarak²⁺ dNTP'lere bağlanır ve bunların dahil olma oranını azaltarak, spesifik olmayan oranı artırır. dNTP, Mg ile birleşebilen fosfat içerir²⁺ serbest Mg konsantrasyonunu azaltmak için²⁺, bu nedenle konsantrasyonundaki değişiklik Mg'nin etkili konsantrasyonunu etkileyecektir²⁺Yüksek konsantrasyonlu DNA ve dNTP koşulları altında, Mg²⁺ konsantrasyon buna göre ayarlanmalıdır. Ayrıca, dNTP'lerin kıtlığı eksik PCR ürünlerine yol açar. Ancak, optimum konsantrasyonları aşan dNTP'ler PCR'yi inhibe edebilir. DNA polimeraz tarafından etkili bir şekilde dahil edilmesi için, reaksiyonda serbest dNTP'ler en az 0,01-0,015 mM konsantrasyonda mevcut olmalıdır.

3. Yüksek saflıktaki dNTP’nin sahip olması gereken özellikler nelerdir?

Polimeraz zincir reaksiyonu, keşfedildiği günden bu yana moleküler genetik araştırmalarda kullanılan eşsiz bir araçtır. dNTP, büyüyen DNA zincirini genişletmek için PCR'de kullanılır. Sistemdeki dNTP kalitesi düşük olsa bile, nihai ürün özellikleri üzerinde olumsuz bir etkisi olacaktır. Yeasen'in Yüksek saflıktaki dNTP'si, her türlü son derece hassas ve tekrarlanabilir DNA sentezi uygulaması için uygundur.

Yeasen, pH 7.0'da saflaştırılmış suda sodyum tuzları olarak tedarik edilen kullanıma hazır GMP sınıfı nükleotidler, setler ve karışımlar sunar. Üretim süreci safsızlıkları ve PCR'ye özgü inhibitörleri ortadan kaldırır ve dNTP'ler moleküler biyoloji uygulamaları için özel olarak üretilir. dNTP'ler preparatif HPLC ile saflaştırılır ve en az %99 saflığa sahiptir. PCR, RT-qPCR, LAMP, DNA etiketleme ve DNA dizileme süreçlerinde kullanılabilirler.
Sıkı kontrol standartları ve son teknoloji, ürünün en iyi kalitesini garanti eder. Her dNTP partisi çeşitli kalıntılar (Bakteriyel DNA, insan DNA'sı, DNase, RNase, Endonükleaz) açısından test edilir.Ürün partiden partiye stabil olup her türlü yüksek hassasiyetli ve tekrarlanabilir DNA sentezi uygulamaları için uygundur.

4. İlgili ürünler ve performans

4.1 Bakteriyel DNA Kalıntısı Yok

Şekil 1. Tespit sonuçları, dNTP’lerin bakteriyel genom kalıntılarına sahip olmadığını göstermektedir.

4.2 İnsan DNA kalıntısı yok

Şekil 2. Tespit sonuçları dNTP’lerin insan genomunda kalıntıya sahip olmadığını göstermektedir.

4.3 DNase, RNase ve Endonükleaz kontaminasyonu yok

Şekil 3. Tespit sonuçları dNTP’lerin DNase, RNase ve Endonükleaz enzimlerine sahip olmadığını göstermektedir.

4.4 PCR amplifikasyonu (20 kb DNA)

Şekil 4. PCR amplifikasyon sonucu beklenen 20 kb ürünüdür.

4.5 Ürün bilgileri

Yeasen’in sağladığı ürünler aşağıdaki gibidir.

Tablo 1.Ürün bilgisi