อะแดปเตอร์ NGS ซึ่งเป็นส่วนสำคัญของไลบรารีการจัดลำดับยีนรุ่นถัดไป มีบทบาทในการเชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA ที่ผ่านการทดสอบกับเซลล์โฟลว์ (ชิปการจัดลำดับยีน) ประสิทธิภาพของข้อต่อเป็นปัจจัยสำคัญในการกำหนดคุณภาพและผลผลิตของไลบรารี อะแดปเตอร์ NGS คืออะไร อะแดปเตอร์ NGS มีประเภททั่วไปอะไรบ้าง และจะเลือกอะแดปเตอร์ NGS ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับแพลตฟอร์มการจัดลำดับยีนของคุณได้อย่างไร

1. NGS Adapter คืออะไร?

2. ปัจจัยใดบ้างที่คุณควรพิจารณาเมื่อเลือกดัชนี NGS?

3. ประเภทดัชนีทั่วไปมีอะไรบ้าง?

4. อะแดปเตอร์ NGS มีประเภททั่วไปอะไรบ้าง?

• อะแดปเตอร์ UMI
• อะแดปเตอร์ครบชุด
• อะแดปเตอร์ไม่สมบูรณ์
• อะแดปเตอร์ Tn5

5. จะเลือกอะแดปเตอร์ NGS ที่เหมาะสมสำหรับแพลตฟอร์มการจัดลำดับของคุณได้อย่างไร

6. เรื่องการอ่าน

1. NGS Adapter คืออะไร?

อะแดปเตอร์ NGS เป็นชุดอะแดปเตอร์ในการจัดลำดับนิวคลีโอไทด์สั้นที่มีลำดับที่ทราบแล้ว โดยจะเชื่อมต่อกับปลายทั้งสองด้านของชิ้นส่วนกรดนิวคลีอิกเป้าหมาย ในระหว่างการจัดลำดับ อะแดปเตอร์จะเริ่มจัดลำดับโดยไฮบริดไดซ์กับลำดับที่ทราบแล้วบนเซลล์โฟลว์เพื่อรวมไลบรารีเข้ากับชิป แล้วโครงสร้างของอะแดปเตอร์ NGS คืออะไร?

โดยใช้แพลตฟอร์ม Illumina เป็นตัวอย่าง อะแดปเตอร์ NGS สามารถแบ่งออกได้เป็น 3 ส่วน:

P5 และ P7: ลำดับที่รวมกับปลาย P5 และ P7 บนเซลล์โฟลว์เพื่อแก้ไขไลบรารีบนชิปการจัดลำดับ อำนวยความสะดวกในการตอบสนองคลัสเตอร์ผ่าน Bridge-PCR

Rd1 SP และ Rd2 SP (ไพรเมอร์ลำดับ Read1/Read2) - บริเวณที่จับกับไพรเมอร์ลำดับ ระบุตำแหน่งที่ลำดับเริ่มถูกอ่าน

ดัชนี (เรียกอีกอย่างว่าบาร์โค้ด): ลำดับสังเคราะห์ที่รู้จักซึ่งใช้เพื่อแยกแยะตัวอย่างต่างๆ ในการจัดลำดับของไลบรารีแบบผสม

มะเดื่อ. 1 ไลบรารีดัชนีเดียวของแพลตฟอร์ม Illumina

มะเดื่อ. 2 ไลบรารีดัชนีปลายเดียวของแพลตฟอร์ม MGI

เมื่อปริมาณงานในการเรียงลำดับเพิ่มมากขึ้น ก็สามารถเรียงลำดับตัวอย่างได้หลายตัวอย่างในเวลาเดียวกัน ดังนั้น การแยกแยะตัวอย่างที่หลากหลายจึงมีความสำคัญเป็นอย่างยิ่ง ดังที่ได้กล่าวไปก่อนหน้านี้ ลำดับดัชนีของอะแดปเตอร์ NGS ใช้เพื่อแยกแยะตัวอย่างต่างๆ ในการจัดลำดับรุ่นถัดไป (NGS) คุณควรพิจารณาปัจจัยใดบ้างเมื่อเลือกดัชนี โปรดอ่านต่อ...

2. ปัจจัยใดบ้างที่คุณควรพิจารณาเมื่อเลือกดัชนี?

ดัชนีโดยทั่วไปจะมีความยาว 6nt-18nt และแบ่งออกเป็นดัชนีเดี่ยวและดัชนีคู่ตามจำนวนดัชนี ดัชนีคู่จะอยู่ที่ปลายทั้งสองด้านของชิ้นส่วนที่จะทดสอบ ควรพิจารณาความสมดุลของฐานและความสมดุลของฟลูออเรสเซนต์เมื่อเลือกชุดดัชนี

ยอดคงเหลือฐานหมายถึงยอดคงเหลือระหว่างดัชนีหลายตัว แทนที่จะเป็นยอดคงเหลือฐานในดัชนีตัวเดียว จำเป็นต้องพิจารณาจากทั้งประเภทฐานและการกระจายฐาน หลักการรวมกันคือต้องรวมฐานทั้งสี่ A/T/C/G ในกลุ่มดัชนีเดียวกัน และสัดส่วนของฐานทั้งสี่นี้จะใกล้เคียงกัน คิดเป็นประมาณ 25% ตามลำดับ

ความสมดุลของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์หมายถึงการเลือกเพื่อให้แน่ใจว่าสัญญาณฟลูออเรสเซนต์มีความสมดุลเมื่อไม่สามารถรับประกันความสมดุลของฐานได้ ในเครื่องเรียงลำดับ 4 ช่องสัญญาณในแพลตฟอร์ม Illumina นั้น dG/dT จะถูกติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์สีเขียว และ dC/dA จะถูกติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์สีแดง ในระหว่างการเรียงลำดับ จะต้องมีสัญญาณเรืองแสงทั้งสีเขียวและสีแดงในแต่ละรอบเพื่อให้แน่ใจว่าการเรียงลำดับจะประสบความสำเร็จ ดังนั้นควรพิจารณาความสมดุลระหว่างสัญญาณสีเขียวและสัญญาณสีแดงเมื่อทำการเลือกดัชนี

3. ประเภทดัชนีทั่วไปมีอะไรบ้าง?

ดัชนีคู่ทั่วไปมักได้แก่ ดัชนีคู่ที่ไม่ซ้ำใคร (UDI), บาร์โค้ดคู่ที่ไม่ซ้ำใคร (UDB) และดัชนีคู่แบบรวม (CDI) ซึ่งช่วยลดการกระโดดดัชนีและการกำหนดที่ไม่ถูกต้องได้อย่างมาก

UDI&UDB: ดัชนีทั้งสองด้านเป็นแบบหนึ่งต่อหนึ่ง ออกแบบเป็นกลุ่ม และสามารถตรวจสอบไขว้กันได้ทั้งสองด้าน

ชุดไพรเมอร์ Stubby UDI สำหรับ Illumina จัดทำโดย Yeasen (รหัสสินค้า: 12404ES/12405ES)>>

CDI: ดัชนีทั้งสองด้านสามารถรวมกันได้ตามข้อกำหนดบางประการเพื่อสร้างไลบรารีดัชนีสองด้าน

ไพรเมอร์ A 384 CDI สำหรับ Illumina ชุดที่ 1-ชุดที่ 2 จัดทำโดย Yeasen (แมว#12412ES-12413ES-

เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพผลผลิตและการขยายสัญญาณ และลดต้นทุนการจัดลำดับ Illumina จึงได้แนะนำเซลล์การไหลของอาร์เรย์ (PFCT) และเทคโนโลยีคลัสเตอร์การขยายสัญญาณเฉพาะ (ExAmp) สำหรับ Novaseq และเครื่องจัดลำดับผลผลิตสูงอื่นๆ แต่ได้ขยายปรากฏการณ์ความไม่ตรงกันของฉลากตัวอย่างและการกระโดดดัชนีโดยไม่ได้ตั้งใจ

รูปที่ 3 แบบจำลองเครื่องมือ Illumina ที่แตกต่างกันใช้เซลล์การไหลแบบไม่มีรูปแบบหรือเซลล์การไหลแบบมีรูปแบบ

เพื่อชดเชยปัญหาการวนซ้ำของดัชนีที่เน้นโดยแพลตฟอร์มการจัดลำดับเช่น HiSeq3000/4000, HiSeq X Series และ NovaSeq บริษัท Illumina เสนอแนวทางการวางดัชนีไว้ที่ปลายทั้งสองด้านของไลบรารี ซึ่งสามารถทำการตรวจสอบแบบทวิภาคีและกำจัดอะแดปเตอร์ที่ไม่ตรงกันได้ เมื่อใช้ดัชนีที่ไม่ซ้ำกันที่ปลายทั้งสองด้าน อัตราการจัดสรรข้อผิดพลาดของดัชนีจะลดลงเหลือ 0.01% เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการรวมกลุ่มการเรียงสับเปลี่ยนดัชนีแบบเดิม การวนซ้ำของดัชนีจะลดลงสองลำดับความสำคัญ

ในการสร้างไลบรารีที่ปราศจาก PCR จะมีอะแดปเตอร์ดัชนีปลายเดียวให้เลือกใช้ ความไม่ตรงกันของฉลากส่วนใหญ่มักเกิดจากข้อผิดพลาดในการเรียงลำดับ โดยรวมแล้ว อัตราความไม่ตรงกันของฉลากนั้นต่ำ (เฉลี่ย 0.0004% สูงสุด 0.001%) อย่างไรก็ตาม ในการสร้างไลบรารีการจับข้อมูลแบบกำหนดเป้าหมาย ปัญหาครอสทอล์คจะทวีความรุนแรงขึ้น เนื่องจากขั้นตอนหลายขั้นตอนจะนำไปสู่ความไม่ตรงกันของฉลาก และโดยปกติแล้วจะใช้อะแดปเตอร์ UDI/UDB/CDI

4.อะแดปเตอร์ NGS มีประเภททั่วไปอะไรบ้าง?

ด้วยการพัฒนาของเทคโนโลยีการจัดลำดับ จึงมีอะแดปเตอร์ประเภทต่างๆ เพิ่มมากขึ้นเรื่อยๆ เช่น อะแดปเตอร์ดัชนีเดี่ยว/ดัชนีคู่ (ดังที่กล่าวถึงในหัวข้อที่ 3) อะแดปเตอร์ UMI อะแดปเตอร์ทรานสโพเซส อะแดปเตอร์สมบูรณ์/ไม่สมบูรณ์ เป็นต้น ซึ่งเหมาะสำหรับสถานการณ์การใช้งานที่หลากหลาย ส่วนนี้จะจัดเรียงอะแดปเตอร์เหล่านี้อย่างเป็นระบบเพื่อให้คุณมีพื้นฐานในการเลือกอะแดปเตอร์

4.1 อะแดปเตอร์ UMI

อะแดปเตอร์ระบุโมเลกุลเฉพาะ (UMI) เป็นเครื่องมือขั้นสูงสำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ความถี่ต่ำและการวัดปริมาณแบบสัมบูรณ์ UMI เป็นลำดับสังเคราะห์แบบสุ่มที่มีลำดับที่ทราบ สามารถออกแบบเป็นโซ่นิวคลีโอไทด์แบบสุ่มอย่างสมบูรณ์ โซ่นิวคลีโอไทด์ที่เสื่อมสภาพบางส่วน หรือโซ่นิวคลีโอไทด์คงที่ความยาวโดยทั่วไปคือ 10nt (UMI ปลายเดียว) หรือ 5-8nt (UMI ปลายคู่) หน้าที่ของมันคือตรึงสถานะของชิ้นส่วน DNA ก่อนการขยาย และโมเลกุล DNA แต่ละโมเลกุลจะสอดคล้องกับ UMI ดังนั้นในระหว่างการวิเคราะห์ชีวสารสนเทศ มันสามารถแยกแยะเทมเพลต DNA จากแหล่งต่างๆ แยกแยะว่าอันไหนคือการกลายพันธุ์ที่เป็นบวกเท็จซึ่งเกิดจากข้อผิดพลาดแบบสุ่มในกระบวนการขยายและการจัดลำดับด้วย PCR และอันไหนที่ผู้ป่วยเป็นพาหะ เพื่อกรองสัญญาณรบกวนพื้นหลัง ตรวจจับการกลายพันธุ์ความถี่ต่ำและความถี่ต่ำมากได้อย่างแม่นยำ และวัดปริมาณโมเลกุล DNA ที่แตกต่างกันได้แน่นอน มันถูกนำไปใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจจับการกลายพันธุ์ความถี่ต่ำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสาขาการวิจัยเนื้องอก

รูปที่ 4 แผนผังของอะแดปเตอร์ UMI โครงสร้างของแพลตฟอร์ม Illumina

4.2 อะแดปเตอร์ครบชุด

อะแดปเตอร์ครบชุด ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ที่จำเป็นสำหรับไลบรารีที่ปราศจาก PCR ประกอบด้วยลำดับทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการจัดลำดับ เช่น P5, P7, RdS1 และ RdS2 ในแพลตฟอร์ม Illumina นอกจากนี้ยังมีลำดับดัชนีและลำดับ UMI ตามข้อกำหนดสำหรับการจัดลำดับ ด้วยอะแดปเตอร์ครบชุด จึงสามารถจัดลำดับได้โดยตรงโดยไม่ต้องใส่อะแดปเตอร์อื่นผ่าน PCR ดังนั้น อะแดปเตอร์ครบชุดจึงสามารถใช้สร้างไลบรารีที่ปราศจาก PCR ได้ ไลบรารีที่ปราศจาก PCR สามารถลดอคติการขยาย PCR อัตราข้อผิดพลาด และการทำซ้ำของลำดับ ทำให้ครอบคลุมพื้นที่ GC สูงหรือ AT สูงบางส่วนได้มากขึ้น ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยจีโนมประชากร

ผลิตภัณฑ์อะแดปเตอร์ที่สมบูรณ์สำหรับแพลตฟอร์ม Illumina ที่จัดหาโดย Yeasen (รหัสสินค้า 13519ES/13520ES)>>

ผลิตภัณฑ์อะแดปเตอร์ที่สมบูรณ์สำหรับแพลตฟอร์ม MGI ที่จัดหาโดย Yeasen(รหัสสินค้า 13360ES/13361ES)>>

รูปที่ 5 แผนผังอะแดปเตอร์แบบสมบูรณ์

4.3 อะแดปเตอร์ที่ไม่สมบูรณ์

อะแดปเตอร์ที่ไม่สมบูรณ์จำเป็นต้องแนะนำลำดับอื่น ๆ โดย PCR หลังจากการเชื่อมต่ออะแดปเตอร์เพื่อสร้างอะแดปเตอร์ที่สมบูรณ์ อะแดปเตอร์เหล่านี้มีลักษณะเฉพาะคือประสิทธิภาพการเชื่อมต่อสูงและอัตราไลบรารีที่มีประสิทธิผลสูง กระบวนการ PCR เป็นเอฟเฟกต์การเสริมประสิทธิภาพสำหรับไลบรารีที่สมบูรณ์เพื่อให้แน่ใจว่าไลบรารีที่มีประสิทธิผลมีความเข้มข้น และยังสามารถแนะนำดัชนีปลายคู่และลำดับ UMI ได้อีกด้วย

4.4 อะแดปเตอร์ Tn5

อะแดปเตอร์ Tn5 เชื่อมต่อส่วนหนึ่งของลำดับอะแดปเตอร์กับปลายทั้งสองข้างของชิ้นส่วน DNA ผ่านกิจกรรมเอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสของ Tn5 อะแดปเตอร์นี้ทำการแบ่งส่วนและผูกอะแดปเตอร์พร้อมกันเพื่อประหยัดเวลาและตัวอย่าง ในที่สุด ลำดับลิงก์เกอร์ ดัชนี UMI และลำดับอื่นๆ ที่เหลือจะถูกนำเข้าสู่ PCR เพื่อสร้างไลบรารีที่สมบูรณ์ ซึ่งสามารถใช้เพื่อสร้างไลบรารี Cut&tag ได้

รูปที่ 6 แผนผังของการสร้างไลบรารีอะแดปเตอร์ Tn5

5. จะเลือกอะแดปเตอร์ NGS ที่เหมาะสมสำหรับแพลตฟอร์มการจัดลำดับของคุณได้อย่างไร

ปัจจุบันมีแพลตฟอร์มการจัดลำดับยีนหลักอยู่ 2 แพลตฟอร์ม ได้แก่ Illumina และ MGI Yeasenโซลูชันที่สมบูรณ์แบบสำหรับผู้ให้บริการ NGS ได้พัฒนาอะแดปเตอร์ NGS หลายตัวที่เหมาะกับแพลตฟอร์ม Illumina หรือ MGI

ในแง่ของแพลตฟอร์ม Illumina อะแดปเตอร์ Illumina NGS จัดหาโดย Yeasen มีสามประเภท ได้แก่ UDI, CDI และดัชนีเดี่ยว ในแง่ของแพลตฟอร์ม MGI อะแดปเตอร์ MGI NGS ที่นำเสนอโดย Yeasen มีสองประเภท ได้แก่ Dual UMI-UDB และดัชนีเดียวเราได้ระบุข้อมูลผลิตภัณฑ์ไว้ในตารางต่อไปนี้ รวมถึงประเภทของอะแดปเตอร์ ขนาดที่มีจำหน่าย และความเข้มข้นของอะแดปเตอร์และไพรเมอร์ตามลำดับ

อะแดปเตอร์ NGS แบบครบชุดและ UDI ไม่ต้องกังวลเรื่องปัญหาการเชื่อมต่อ เหมาะสำหรับลูกค้าที่ต้องการใช้งานง่าย อะแดปเตอร์ NGS ของ CDI มีหลอดน้อยกว่าและมีขนาดเล็ก เหมาะสำหรับลูกค้าที่ต้องการจัดเก็บและพกพาสะดวก ปราศจาก PCR ต้องใช้อะแดปเตอร์ NGS แบบครบชุด

สำหรับ อิลลูมิน่า

อินทูป	ไฮฟ์ เอ็นจีเอส ดีการเตรียมสอบ NA Lib 384 CDI Primer สำหรับ Illumina ชุดที่ 1 (8*12, ดัชนี 96)	12412ES
	ไฮฟ์ เอ็นจีเอส ดีการเตรียมสอบ NA Lib 384 CDI Primer สำหรับ Illumina ชุดที่ 2 (8*12, ดัชนี 96)	12413ES
	ไพรเมอร์ Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI สำหรับ Illumina ชุดที่ 1 (ดัชนี 96)	12414ES
	ไพรเมอร์ Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI สำหรับ Illumina ชุดที่ 1 (ดัชนี 96)	12415ES
ในจาน	ชุดไพรเมอร์ Hieff NGS® Stubby UDI สำหรับ Illumina (ดัชนี 1-384) ชุด 1-4	12407ES
	ชุดไพรเมอร์ Hieff NGS® Stubby UDI สำหรับ Illumina ชุดที่ 1-จาน 96 หลุม ดัชนี 1-96- ชุดที่ 1	12327ES
	ชุดไพรเมอร์ Hieff NGS® Stubby UDI สำหรับ Illumina ชุดที่ 2-จาน 96 หลุม ดัชนี 97-192- ชุดที่ 2	12328ES
	ชุดไพรเมอร์ Hieff NGS® Stubby UDI สำหรับ Illumina ชุดที่ 3-จาน 96 หลุม ดัชนี 193-288- ชุดที่ 3	12329ES
	ชุดไพรเมอร์ Hieff NGS® Stubby UDI สำหรับ Illumina ชุดที่ 4-จาน 96 หลุม ดัชนี 289-384- ชุดที่ 4	12330ES

เรื่องการอ่าน

เอนไซม์สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการสร้างห้องสมุด NGS

คุณมีความรู้เกี่ยวกับเทคโนโลยีที่เกี่ยวข้องกับ NGS มากเพียงใด?

ลูกปัดแม่เหล็กชนิดต่างๆ ใน ​​NGS: ลูกปัดแม่เหล็ก DNA\RNA\mRNA

การวัดปริมาณไลบรารี NGS: Qubit ที่รวดเร็วและแม่นยำหรือ qPCR ที่แม่นยำ จำเป็นทั้งหมด!