เพื่อนที่รัก คุณรู้สึกสูญเสียเมื่อต้องเผชิญกับ Loading Control และ Epitope Tagging Antibodies ต่างๆ ในระหว่างการทำ Protein Immunoblotting หรือไม่? Loading Control โปรตีนถูกเข้ารหัสโดยยีนควบคุมภายในสิ่งมีชีวิตและแสดงออกอย่างเสถียรในเนื้อเยื่อหลายชนิด โปรตีนถูกใช้เพื่อตรวจสอบว่าการทดลองทางภูมิคุ้มกันดำเนินไปตามปกติหรือไม่ และเป็นมาตรฐานการตรวจจับแบบกึ่งเชิงปริมาณสำหรับการแสดงออกของโปรตีน ดังนั้น คุณจะเลือกแอนติบอดีควบคุมการโหลดอย่างถูกต้องได้อย่างไร คุณสามารถอ้างอิงถึงประเด็นต่อไปนี้
I. ตัวอย่างสายพันธุ์ต้นกำเนิด
- สำหรับตัวอย่างจากเนื้อเยื่อหรือเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โดยทั่วไปให้เลือก β-actin, α-tubulin, GAPDH, Lamin-B, Histone H3, Na+/K+-ATPase
- สำหรับตัวอย่างที่ได้จากพืช โดยทั่วไปให้เลือกแอกตินจากพืช รูบิสโก ฯลฯ
- สำหรับตัวอย่างอื่นที่มีการวิจัยน้อยกว่า ให้เลือกโปรตีนที่เหมาะสมเป็นข้อมูลอ้างอิงภายในโดยศึกษาเอกสารหรือฐานข้อมูลที่เกี่ยวข้อง
ให้แน่ใจว่าน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมายแตกต่างจากน้ำหนักโมเลกุลของการควบคุมการโหลด มากกว่า 5KDa เพื่อป้องกันการรบกวนระหว่างการตรวจจับ ตัวอย่างเช่น หากโปรตีนเป้าหมายคือ 40KDa จะไม่เหมาะสมที่จะเลือก β-actin (42KDa) เป็นตัวควบคุมการโหลด พิจารณาใช้ GAPDH (36KDa) หรือ β-tubulin (55KDa) เป็นตัวควบคุมการโหลด
III. ไซต์การแสดงออกของโปรตีนอ้างอิงภายใน
หมายเหตุ: หลีกเลี่ยงสถานการณ์ต่อไปนี้เมื่อใช้งาน โหลดควบคุมแอนติบอดี
| การระบุตำแหน่งย่อยของเซลล์ | โหลดโปรตีนควบคุม | น้ำหนักโมเลกุล (KDa) | หมายเหตุ |
| ไซโทพลาซึม เซลล์ทั้งหมด | เบต้า-แอกติน | 42 | ไม่เหมาะสำหรับสารสกัดนิวเคลียร์ β-แอกตินเป็นส่วนประกอบของคอมเพล็กซ์การปรับโครงสร้างโครมาติน อาจไม่เหมาะสำหรับสถานการณ์ที่ความแตกต่างของอายุในกลุ่มผู้เข้าร่วมการวิจัยมีนัยสำคัญ |
| อัลฟา-ทูบูลิน | 55 | ไม่เหมาะสำหรับสถานการณ์ที่อายุของผู้เข้าร่วมการวิจัยแตกต่างกันอย่างมาก การแสดงออกของทูบูลินจะเปลี่ยนไปเมื่อใช้ยาต้านจุลชีพและยาต้านไมโทซิส ดังนั้นจึงไม่เหมาะสำหรับใช้ร่วมกับยาต้านมะเร็งและยาต้านเชื้อรา | |
| เบต้า-ทูบูลิน | 55 | ||
| GAPDH | 36 | ภาวะเซลล์ขาดออกซิเจนจะทำให้การแสดงออกของ GAPDH เพิ่มขึ้น ดังนั้นจึงไม่เหมาะสำหรับการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับออกซิเจน ปัจจัยต่างๆ เช่น เบาหวาน อาจทำให้การแสดงออกของ GAPDH เพิ่มขึ้น | |
| วินคูลิน | 117 | สามารถอ้างถึงโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลขนาดใหญ่ได้ | |
| ไมโตคอนเดรีย | ซีรีย์ COXIV | 15-17 | โปรตีนซีรีส์นี้ส่วนใหญ่มีความเข้มข้นที่ 15-17KDa หากน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมายใกล้เคียงกัน ให้พิจารณาแอนติบอดีควบคุมการโหลดอื่น |
| HSP60 | 60 |
| |
| นิวเคลียส | วีดีเอซี1/2 | 31-37 | โปรตีนในกลุ่มนี้มีความเข้มข้นอยู่ที่ 31-37KDa เป็นหลัก |
| ลามิน บี1 | 66 | ไม่เหมาะสำหรับเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน ไม่เหมาะสำหรับเป็นตัวควบคุมการโหลด ในการทดลองเรื่องอะพอพโทซิส | |
| พีซีเอ็นเอ | 36 | ไม่เหมาะสำหรับเซลล์ที่ไม่เจริญเติบโต | |
| ทีบีพี | 33-43 | TBP มีค่า 37-43KDa ในมนุษย์ และ 33-36KDa ในหนูและหนูทดลอง ซึ่งไม่เหมาะสำหรับการทดลองอะพอพโทซิส | |
| ปี1 | 65-70 |
| |
| ฮิสโตน เอช 3 | 17 | โปรตีนส่วนใหญ่มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 17KDa หากน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมายใกล้เคียงกัน ให้พิจารณาใช้แอนติบอดีควบคุมโหลดอื่นๆ | |
| เลือดทั้งหมด ซีรั่ม พลาสมา | ทรานสเฟอริน | 77 | การแสดงออกได้รับผลกระทบจากภาวะโรคและการรักษาบางอย่าง เช่น กรดเรตินอยด์ |
| อัลบูมิน | 66 | เนื้อหาค่อนข้างสูง ควรใส่ใจกับการลดการโหลดตัวอย่างในการทดลอง WB |
ฉลากแอนติบอดีทำงานได้ดีขึ้นเมื่อใช้ร่วมกัน
ในการทดลองศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีน เช่น การดึงลง แท็กเอพิโทปสามารถรวมเข้ากับปลาย N หรือ C ของโปรตีนเป้าหมายได้โดยใช้วิธีทางชีววิทยาโมเลกุล แท็กเอพิโทปที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ His, HA, Myc และ GST โดยปกติแล้วแท็กเอพิโทปเหล่านี้จะไม่ส่งผลต่อกิจกรรมทางชีวภาพและตำแหน่งภายในเซลล์ของโปรตีนเป้าหมาย การเกิดขึ้นของแท็กเอพิโทปทำให้การวิจัยทางวิทยาศาสตร์และการผลิตทางอุตสาหกรรมสะดวกยิ่งขึ้น
| แท็กเอพิโทป | ลำดับแท็ก | น้ำหนักโมเลกุล -เคดีเอ- |
| แท็ก HA | ยพยดวปดยา | 1.1 |
| แท็ก MYC | อีคิวเคลิสซีดล์ | 1.2 |
| ป้ายธง | DYKDDDDK | 1 |
| ป้ายภาษี GST | - | 26 |
| แท็ก GFP | - | 26.9 |
| แท็ก V5 | จีเคพีพีเอ็นพีแอลจีดีเอสที | 1.4 |
| เอสแท็ก | เคตาอักเฟอร์กฮมดีส | 1.8 |
| อีแท็ก | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 |
ข้อมูลสินค้า
| พิมพ์ | ชื่อสินค้า | น้ำหนักโมเลกุล -เคดีเอ- | หมายเลขสินค้า |
| โหลดควบคุมแอนติบอดี | β-แอกติน, mAb ของเมาส์ | 42 | 30101ES |
| เบต้า-แอกติน กระต่าย pAb | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (โคลน:1A6), mAb ของเมาส์ | 36 | 30201ES | |
| GAPDH, กระต่าย pAb | 36 | 30202ES | |
| α-Tubulin, mAb ของเมาส์ | 50-55 | 30304ES | |
| β-ทูบูลิน, mAb ของเมาส์ | 50-55 | 30301ES | |
| เบต้า-ทูบูลิน กระต่าย pAb | 50-55 | 30302ES |