Hieff NGS^TM OnePot Pro DNA Library Prep Kit V3 är en ny generation enzymatisk fragmenteringsbaserad biblioteksförberedelsesats speciellt utvecklad och designad för Illumina &MGI-sekvenseringsplattform. Jämfört med traditionella bibliotekskonstruktionsmetoder använder denna produkt högkvalitativa fragmenteringsenzymer, vilket eliminerar den besvärliga ultraljudsprocessen. Det förenklar operationen genom att kombinera fragmenterings- och slutreparationsmodulerna till en. Dessutom är enzymerna och bufferten för ligeringsmodulen förblandade, vilket avsevärt minskar tiden och kostnaden för bibliotekskonstruktion. Detta gör den mer lämpad för automatiserad bibliotekskonstruktion. Detta biblioteksförberedande kit har en utmärkt biblioteksomvandlingshastighet och är tillämplig för prover från alla vanliga djur, växter, mikroorganismer, etc., och även FFPE-proverna. På basis av den tidigare generationens biblioteksbyggsats uppvisar denna produkt högre effektivitet i fragmentering, slutreparation, dA-tailing och adapterligering än de tidigare versionerna. High-fidelity-enzymet förbättrar avsevärt likformigheten och troheten i amplifieringen.

Specifikationer

Komponenter

[Notera]: Kitkomponenterna är kompatibla med båda Illumina &MGI sekvenseringsplattform, om hela adaptern användes, Hieff NGS^TM Primer Mix (Yeasen Cat#12190 eller Cat#12191) behövs.

Lagring

Denna produkt bör förvaras vid -25~-15 ℃ för 1 år.

Anteckningar

1. Om operationen

1. Använd labbrockar och engångshandskar，för din säkerhet.

2. Tina komponenterna i rumstemperatur. Efter upptining, blanda noggrant genom att vortexa, snurra röret kort och lägg dem på is för senare användning.

3. När du förbereder reaktionslösningen för varje steg, rekommenderas det att använda en pipett för att blanda väl eller skaka försiktigt. Kraftig skakning kan orsaka en minskning av bibliotekets utdata.

4. Det rekommenderas starkt att använda filtrerade pipettspetsar för att undvika korskontaminering. Se till att byta pipettspetsar när du bearbetar olika prover.

5. Felaktiga åtgärder kan med stor sannolikhet orsaka aerosolkontamination, vilket påverkar resultatets noggrannhet. Obligatorisk fysisk isolering av PCR-reaktionsblandningsregioner och PCR-produktreningsanalysregioner rekommenderas. Utrustad med utrustning såsom specialiserade pipetter för bibliotekskonstruktion. Utför rutinmässig rengöring för varje område genom att torka av ytorna med 0,5 % natriumhypoklorit eller 10 % blekmedel

6. Denna produkt är endast avsedd för forskning.

2. DNA-fragmentering

1. Satsen är kompatibel med 100 pg - 1000 ng ingående DNA. Det rekommenderas starkt att använda ingående DNA av hög kvalitet med A260/A280 = 1,8-2,0.

2. Följande experiment skulle kunna påverkas om höga koncentrationer av salter som metallkelatbildaren infördes med inmatat DNA. Vi rekommenderar att du eluerar DNA-provet ddH₂O för fragmentering.

3. Se tabellen 6 för fragmenteringstiden för standard-DNA-prover. Satsen har låg fragmenteringsbias och ger enhetlig GC-täckning för DNA-prover med ett brett utbud av GC-kompositioner. Justera fragmenteringstiden baserat på dina experimentella krav.

4. För korrekt fragmentering, förbered reaktionen på is.

3. Adapter Ligation

1. Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kit och kort Adapter kit finns tillgängliga för kunderna att välja enligt deras experimentella krav.

2. Att välja kommersiella adaptrar av hög kvalitet rekommenderades. Om egentillverkade adaptrar väljs, anförtro ett företag med erfarenhet av NGS-primersyntes och påpeka behovet av strikt kontamineringskontroll. Dessutom rekommenderas att förbereda DNA-glödgningslösning på en ren bänk och endast använda en typ av adapter varje gång för att förhindra korskontaminering.

3. Tina adaptrarna på isen eller vid 4°C; vid drift i rumstemperatur bör laboratorietemperaturen inte överstiga 25°C för att förhindra att adaptrarna denatureras.

4. Adaptrarnas kvalitet och koncentration kommer direkt att påverka ligeringseffektiviteten och biblioteksutbytet. För hög koncentration av adaptrar gynnar adapterdimerbildning medan för lite adapter minskar ligeringshastighet och biblioteksutbyte. Motsvarande spädningar med TE-buffert enligt ingående DNA-mängd vid användning av adapter. Tabell 1-2 listar de rekommenderade utspädningsmetoderna för konventionella adaptrar och UMI-adaptrar för olika mängder inmatat DNA som använder detta kit för Illumina- eller MGI-sekvenseringsplattformarna.

Tabell 1 Den rekommenderade Illumina adaptermängd för olika ingångar DNA

Tabell 2 Den rekommenderade MGI adaptermängd för olika ingångar DNA

4. Pärlbaserad DNA-rensning och storleksval

1. DNA-storleksval kan utföras före ändreparation/dA-svansning, efter adapterligering eller efter amplifiering.

2. Det rekommenderas att utföra storleksval direkt efter adapterligering om den ingående DNA-mängden är mer än 50 ng; Utför annars storleksval efter förstärkning.

3. Ligation Enhancer innehåller en hög koncentration av PEG, vilket kan ha en betydande inverkan på exakt storleksval. Således, om storleksval ska utföras direkt efter adapterligering, rekommenderas det starkt att lägga till ett pärlorrensningssteg före storleksvalet. Storleksvalssteget kan utföras direkt om det utförs före slutreparationen/dA-svansningen eller efter biblioteksförstärkningen.

4. De magnetiska pärlorna bör utjämnas vid rumstemperatur före användning, annars kommer utbytet att minska och storleksvalseffekten påverkas.

5. De magnetiska pärlorna ska blandas väl genom virvel eller pipettering före användning.

6. Aspirera inte pärlorna när du överför supernatanten, även spårmängder av pärlorna kan påverka följande reaktioner.

7. Etanolen på 80 % bör vara nyberedd, annars kommer det att påverka återvinningseffektiviteten.

8. För korrekt storleksval rekommenderas att börja med en volym på mer än 100 μL. Om mindre, rekommenderas det att höja volymen till 100 μL med ultrarent vatten.

9. De magnetiska pärlorna bör torkas i rumstemperatur innan produkten elueras. Otillräcklig torrhet leder lätt till att etanolrester påverkar efterföljande reaktioner; överdriven torrhet gör att de magnetiska pärlorna spricker och minskar reningsutbytet. Normalt räcker det att torka i rumstemperatur i 3-5 minuter för att pärlorna ska torka helt.

10. Vid behov eluerades de renade eller storleksvalda DNA-proverna in 0,1× TE-buffert kan förvaras vid 4°C i 1-2 veckor eller vid -20°C i en månad.

5. Biblioteksförstärkning

1. Huruvida biblioteksamplifiering ska utföras eller inte beror på mängden DNA-inmatning, typer av adaptrar, sekvenseringsdataapplikationerna, etc. Amplifieringssteget krävs om man använder partiella adaptrar. Vid användning av fullängdsadaptrar, om inmatat DNA<200 ng, rekommenderas att utföra amplifiering; annars är förstärkning inte nödvändig.

2. Antalet amplifieringscykel bör vara strikt kontrollerade. Otillräcklig amplifiering kan leda till lågt biblioteksutbyte; Överförstärkning kan introducera ökad bias, fel, duplicerad läsning och chimära produkter. Tabell 3 listar rekommenderade cykelnummer som är inriktade på biblioteksutbytet på 1 μg.

Tabell 3 Det rekommenderade antalet cykler att generera 1 000 ng biblioteksutbyte

Notera

1.Tabell 3 visar antalet loopparametrar med högkvalitativa Input DNA-tester på cirka 200 bp. FFPE DNA-kvaliteten varierar mycket, och när DNA-kvaliteten är dålig eller bibliotekslängden är lång måste antalet cykler ökas på lämpligt sätt för att få tillräckligt med bibliotek.

2. Om storleksval krävs under biblioteksbyggandet rekommenderas ett högre cykelnummer för biblioteksförstärkning; annars rekommenderas lägre cykelnummer.

3.Om ofullständiga adaptrar används måste minst 2 cykler förstärkas för att bilda en komplett adapter.

6. Bibliotekskvalitetsanalys

1. Kvaliteten på de konstruerade biblioteken analyseras i allmänhet genom att mäta koncentrationer och storleksfördelningar.

2. Bibliotekens koncentrationer kan mätas med fluorescensbaserade metoder som Qubit och PicoGreen eller qPCR.

3. Det rekommenderas INTE att använda absorbansbaserade kvantifieringsmetoder såsom NanoDrop.

4. Det rekommenderas att använda qPCR-metoden för bibliotekskvantifiering: fluorescensbaserade metoder som Qubit och PicoGreen kan inte skilja de ofullständiga dsDNA-strukturerna (inserts utan adapter eller med endast en av ändarna ligerad med adapter) från de kompletta biblioteken. qPCR-metoden kommer endast att amplifiera och mäta de kompletta biblioteken med båda ändarna ligerade med adaptrar (de sekvenserbara biblioteken), vilket ger en mer exakt mätning för laddning.

5. Storleksfördelningen av bibliotek kan analyseras med hjälp av Agilent Bioanalyzer eller andra enheter baserade på principerna för kapillärelektrofores eller mikrofluidik.

7. Andra material

1. DNA-rening magnetiska pärlor: Hieff NGS^TM DNA-selektionspärlor (Yeasen Cat#12601) eller AMPure^® XP Beads (A63880) eller andra likvärdiga produkter.

2.Adaptrar: Komplett adapter för Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Dual CDI Primers: Yeasen Katt#12412~Katt#12413; 384 Unique Dual Index (UDI) Primers: Yeasen Katt#12312~Katt#12315; UMI UDI-adaptrar: Yeasen Katt#13370~Katt#13371; Komplett adapter för MGI: Yeasen Cat#13360-13362. DNA Primer Mix:Katt#12190 eller Katt #12191.

3. Bibliotekskvalitetsanalys: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip eller andra likvärdiga produkter; bibliotekets kvantitativa reagens.

4. Andra material: absolut etanol, sterilt ultrarent vatten, pipettspetsar med låg retention, PCR-rör, magnetstativ, termocykler, etc.

8. Arbetsflöde

Figur 1. Arbetsflödet för OnePot Pro DNA Förberedelsesats för bibliotek

Siffror

Storleken på insättningsfragment erhållna under olika fragmenteringsbetingelser

Med användning av 500 ng standard gDNA som mall, konstruerades bibliotek med detta kit. Fragmenteringsbetingelserna var enzymatisk digerering vid 32°C, 35°C och 37°C under 5, 10, 15, 20 respektive 30 minuter. De fragmenterade produkterna renades med 1,2x magnetiska pärlor och eluerades med 21 μL ddH₂O. Koncentrationen mättes med Qubit, och fördelningen av återvunna insertfragment visas i följande figur.

Figur 2. Biblioteksprofiler vid 32°C för olika enzymnedbrytningstider

Figur 3. Biblioteksprofiler vid 35 °C för olika enzymuppslutningstider

Figur 4. Biblioteksprofiler vid 37 °C för olika enzymuppslutningstider