HEK293 Detectiekit voor DNA-residuen van gastheercellen (3G)
Kwalificatiesamenvatting (Cat.nr.: 4)1331(ES60)
- Achtergrond
De in dit rapport samengevatte gegevens zijn uitgevoerd door
- Experimentele materialen en methoden
2.1 HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G), Leverancier:
2.2 MolPure® Magnetische Residu DNA Monster Voorbereidingskit, Leverancier:
2.3 Originele gegevens: de elektronische versie werd vastgelegd in het 'Experimenteel rapport' het subbestand van het bovenliggende bestand 'HEK293 Detectiekit voor DNA-residuen van gastheercellen (3G).
2.4 Methoden: De materialen en werkwijzen die voor het experiment werden gebruikt, werden in principe door de fabrikant geproduceerd of vastgesteld.
- Kwalificatie-inhoud en resultaten
3.1 Detectiebereik
Het lineaire bereik van de kit was 30 fg/μL~300 pg/μL met R2≥0,998, en de amplificatie-efficiëntie bedroeg 90%~110% met CV<15% voor elke concentratietest.
Figuur 1 HEK293 DNA (3G) qPCR-standaardcurve
3.2 Nauwkeurigheid
3.2.1 Recoverie
3.2.1.1 Blanco monster spike recovery experiment
Voorbeelden van HEK293 DNA-standaarden bij hoge en lage concentraties: respectievelijk 300 pg/μL, 3 pg/μL en 30 fg/μL werden bereid en na extractie geanalyseerd met behulp van de Magnetic Bead Method for Residual DNA Sample Pre-treatment Kit (voor elk monster werden 2 extractiereplicaten uitgevoerd en voor elke extractie werden 3 assayreplicaten uitgevoerd). De monsterwinningen en CV's werden geanalyseerd.
Voor verschillende concentraties DNA-monsters varieerden de terugvindingen van 70% tot 130% en de CV's waren allemaal <20%.
| Voorbeeldtype | Theoretische concentratie | Extract 1 gemiddelde | Extract 2 gemiddelde | Gemiddelde concentratie | CV | Herstel |
| Blanco monster | / | / | / | / | / | / |
| Herstelmonster 1 | 300 pg/μL | 306.81 pg/μL | 279.57 pg/μL | 293,82 pg/μL | 6,56% | 97,94% |
| Herstelmonster 2 | 3 pg/μL | 3.11 pg/μL | 2,99 pg/μL | 3.09 pg/μL | 2,75% | 103,00% |
| Herstelmonster 3 | 30 fg/μL | 31.02 fg/μL | 30.63 fg/μL | 30.83 fg/μL | 0,89% | 102,77% |
Tabel 1 Herstel van blanco monster-spiking
3.2.1.2 Gesimuleerd monster-spiking-herstelexperiment
Monsters met dezelfde concentratie (3 pg/μL HEK293-DNA) werden geëxtraheerd (voor elk monster werden 2 extractie-replicaten uitgevoerd en voor elke extractie werden 3 assay-replicaten uitgevoerd) met 5 verschillende achtergrondoplossingen (hoog eiwitgehalte, hoog nucleïnezuurgehalte, hoge en lage pH, hoog zoutgehalte) en de monsterwinningen en CV's werden geanalyseerd.
Het teruggevonden DNA-monster voor verschillende achtergrondoplossingen varieerde van 70% tot 130%, waarbij alle CV's <20% waren.
| Voorbeeldtype | Theoretische concentratie | Extract 1 gemiddelde | Extract 2 gemiddelde | Gemiddelde concentratie | CV | Herstel |
| Basismonster | / | / | / | / | / | / |
| Veel eiwitten | 3 pg/μL | 2.65 | 2.80 | 2.73 | 3,80% | 90,87% |
| Hoog nucleair zuur | 2.82 | 2.97 | 2.90 | 3,71% | 96,58% | |
| Hoog zoutgehalte | 2.88 | 2.70 | 2.79 | 4,47% | 92,89% | |
| Hoge pH | 2.81 | 2.93 | 2.87 | 2,98% | 95,71% | |
| Lage pH | 2.76 | 2.79 | 2.77 | 0,99% | 92,48% |
Tabel 2 Basismonster Spiking Recovery
3.3 Precisie
3.3.1 Herhaalbaarheid
Herhaal de test 10 keer voor HEK293 DNA-standaarden bij een concentratie van 30 fg/μL met een CV <15%.
| Herhalingen | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Gemeen | CV% |
| Detectiewaarde (fg/μL) | 29.51 | 30.02 | 30.13 | 30.16 | 27,99 | 31.01 | 31.05 | 30,95 | 31.02 | 29.86 | 30.17 | 3,15% |
Tabel 3 Herhaalbaarheidsresultaten
3.3.2 Tussenliggende precisie
Drie experimentatoren testten onafhankelijk van elkaar HEK293-DNA-standaardmonsters bij hoge en lage concentraties: 300 pg/μL, 3 pg/μL en 30 fg/μL. Voor elke concentratie werden drie replicaties uitgevoerd en de CV's van alle negen verkregen gegevens waren <15%.
| Uitgave |
Werkelijke concentratie Theoretische concentratie | HEK293-DNA (3G) | ||
| 300 pg/uL | 3 pg/uL | 30 fg/uL | ||
| Uitgave 1 | Vastberadenheid 1 | 319.58 | 3.026 | 32.02 |
| Vastberadenheid 2 | 309.76 | 3.051 | 37.01 | |
| Vastberadenheid 3 | 309.24 | 3.067 | 36.03 | |
| Uitgave 2 | Vastberadenheid 4 | 308.34 | 2.909 | 29.91 |
| Vastberadenheid 5 | 308.54 | 2.9 | 29.67 | |
| Vastberadenheid 6 | 305,83 | 2.921 | 28.85 | |
| Expeditie 3 | Vastberadenheid 7 | 299.11 | 3.035 | 29.36 |
| Vastberadenheid 8 | 300.07 | 2.833 | 31.14 | |
| Vastberadenheid 9 | 302.03 | 3.033 | 33.07 | |
| / | Gemeen | 306,95 | 2.975 | 31.90 |
| / | CV% | 2,03% | 2,83% | 9,26% |
Tabel 4 Resultaten tussenliggende precisie
3.4 Specificiteit
De interferentie van cellulair genomisch DNA dat gewoonlijk wordt gebruikt bij de productie van biologische producten werd beoordeeld op interferentie met HEK293 DNA-detectiereagentia. De interferentiegroep overlapt met de controlegroep en er werd geen interferentie waargenomen (de onderstaande afbeelding toont, op volgorde, de interferentiegegevens van CHO-, E. coli- en Pichia Pastoris-genomische DNA's met HEK293 DNA-detectiereagentia).
Figuur 2 Resultaten van het interferentie-experiment
3.5 Kwantificeringslimiet
HEK293 DNA werd gedetecteerd bij 30 fg/μL, 20 fg/μL, 10 fg/μL en 5 fg/μL, met 10 replicaties voor elke concentratie. De resultaten toonden aan dat de CV <20% was bij concentraties van 10 fg/μL en hoger. Dat wil zeggen dat de kwantificeringslimiet van de HEK293 host cell DNA residue detection kit (3G) 10 fg/μL was.
|
Herhalingen Testartikel | HEK293-DNA (3G) (fg/μL) | |
| Hoeveelheid | Herberekeningsverhouding% | |
| 1 | 11.04 | 110,40% |
| 2 | 9.97 | 99,70% |
| 3 | 11.12 | 111,20% |
| 4 | 11.07 | 110,70% |
| 5 | 11.21 | 112,10% |
| 6 | 9.93 | 99,30% |
| 7 | 10.25 | 102,50% |
| 8 | 10.16 | 101,60% |
| 9 | 10.08 | 100,80% |
| 10 | 10.11 | 101,10% |
| Gemeen | 10.49 | / |
| CV% | 5,14% | / |
Figuur 3 10fg/μL HEK293 DNA (3G) qPCR-testresultaat
3.6 Robuustheid
Deze kit is getest en geschikt voor, maar niet beperkt tot, de volgende instrumenten:
| Leverancier | Instrumentmodellen | Versterkingsrendementen | R2 | Kwantificeringslimiet (fg/μL) | CV% |
| Thermisch | ABI 7500 | 102,84% | 1 | 10 | 7% |
| Thermisch | ABI QuantStudio5 | 104,70% | 0,999 | 10 | 9% |
| Shanghai Hongshi | SLAN | 101,46% | 0,999 | 10 | 8% |
Tabel 5 Resultaten van de geschiktheidstest voor instrumenten
3.7 Stabiliteit
3.7.1 Vries-dooi stabiliteit
De HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) werd getest door herhaaldelijk 10 keer invriezen en ontdooien, en de prestaties van de kit werden niet beïnvloed.
|
Testindicatoren Vries-dooi tijden | Parameter | T0 tijd | 10 keer invriezen en ontdooien |
| Standaard curveparameter | Versterkingsrendementen | 99,34% | 100,78% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Kwantificeringslimiet (30 fg/μL) | CV | 11% | 7% |
Tabel 6 Analyse van de resultaten van de vries-dooistabiliteit
3.7.2 Versnelde stabiliteit
HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) werden respectievelijk 30 dagen opgeslagen bij 2~8°C en 14 dagen bij 37°C. De prestaties van de kit werden niet beïnvloed.
|
Testindicatoren Versnelling Temperatuur & Tijd | Parameter | T0 tijd | 37℃ 7 dagen | 37℃ 14 Dagen |
| Standaard curveparameter | Versterkingsrendementen | 103,83% | 101,58% | 100,47% |
| R2 | 0,999 | 1 | 1 | |
| Kwantificeringslimiet (30 fg/μL) | CV% | 8% | 5% | 5% |
Tabel 7 Versnelde stabiliteitsresultaatanalyse
3.8 Limiet van blanco
Geen templatecontrole (NTC) was een templateverdunning met 96 herhalingen van CT-waarden >32 (plus ROX-kalibratiedrempellijn ingesteld op 0,06).
Figuur 4 Resultaten van het NTC-experiment
- 4.Referentie
4.1 Chinese Farmacopee Commissie (ChPC). Farmacopee van de Volksrepubliek China (Vol Ⅲ) [S]. Beijing：China Medical Science and Technology Press，p.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Algemene principes voor technische beoordeling van analytische methodevalidatie voor kwaliteitscontrole van biologische producten.
4.3 ICH(2022)《Analytische methodevalidatie Q2》, conceptversie.
Bestel Informatie
| Beschrijving | Onderdeelnummer |
| 41332ES | |
| 41331ES | |
| 41307ES | |
| 41308ES | |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-detectiekit (2G) | 40619ES |