CHO Detectiekit voor DNA-residuen van gastheercellen (3G)
Kwalificatiesamenvatting (Cat.nr.: 41332(ES60)
- Achtergrond
De in dit rapport samengevatte gegevens zijn uitgevoerd door
- Experimentele materialen en methoden
2.1 CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G), Leverancier:
2.2 MolPure Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit, leverancier:
2.3 Oorspronkelijke gegevens: de elektronische versie werd vastgelegd in het 'Experimentrapport' het subbestand van het bovenliggende bestand CHO Detectiekit voor DNA-residuen van gastheercellen (3G).
2.4 Methoden: De materialen en werkwijzen die voor het experiment werden gebruikt, werden in principe door de fabrikant geproduceerd of vastgesteld.
- Kwalificatie-inhoud en resultaten
3.1 Detectiebereik
Het lineaire bereik van de kit was 3 fg/μL~300 pg/μL met R2=1, en de amplificatie-efficiëntie was 99,09% met CV<15% voor elke concentratietest.
Figuur 1 CHO DNA (3G) qPCR-standaardcurve
3.2 Nauwkeurigheid
3.2.1 Recoverie
3.2.1.1 Blanco monster spike recovery experiment
Monsters van CHO DNA-normen bij hoge en lage concentraties: 30 pg/μL, 300 fg/μL en 3 fg/μL werden respectievelijk bereid en geanalyseerd na extractie met behulp van de Magnetic Bead Method for Residual DNA Sample Pre-treatment Kit (3 Voor elk monster werden extractiereplicaten uitgevoerd en voor elke extractie werden 3 assayreplicaten uitgevoerd. De monsterwinningen en CV's werden geanalyseerd.
Voor verschillende concentraties DNA-monsters varieerden de terugvindingen van 70% tot 130% en de CV's waren allemaal <20%.
| Voorbeeldtype | Theoretische concentratie | Extract 1 gemiddelde | Extract 2 gemiddelde | Extract 3 gemiddelde | Gemiddelde concentratie | CV | Herstel |
| Blanco monster | / | / | / |
| / | / | / |
| Herstelmonster 1 | 30 pg/μL | 27.07 | 27.51 | 28.27 | 27.62 | 2,20% | 92,06% |
| Herstelmonster 2 | 300 fg/μL | 285.53 | 301.25 | 295.71 | 294.16 | 2,71% | 98,05% |
| Herstelmonster 3 | 3 fg/μL | 3,50 | 3.54 | 3.31 | 3.45 | 3,56% | 115,00% |
Tabel 1 Herstel van blanco monster-spiking
3.2.1.2 Gesimuleerd monster-spiking-herstelexperiment
Monsters met dezelfde concentratie (300 fg/μL CHO-DNA) werden geëxtraheerd (voor elk monster werden 3 extractie-replicaten uitgevoerd en voor elke extractie werden 3 assay-replicaten uitgevoerd) met 5 verschillende achtergrondoplossingen (hoog eiwitgehalte, hoog nucleïnezuurgehalte, hoge en lage pH, hoog zoutgehalte) en de monsterwinningen en CV's werden geanalyseerd.
Het teruggevonden DNA-monster voor verschillende achtergrondoplossingen varieerde van 70% tot 130%, waarbij alle CV's <20% waren.
| Voorbeeldtype | Theoretische concentratie | Extract 1 gemiddelde | Extract 2 gemiddelde | Extract 3 gemiddelde | Gemiddelde concentratie | CV | Herstel |
| Basismonster | / | / | / |
| / | / | / |
| Veel eiwitten | 300 fg/μL | 302.29 | 332,86 | 342.76 | 325,97 | 6,47% | 108,66% |
| Hoog nucleair zuur | 284.47 | 290.66 | 308.76 | 294.63 | 4,28% | 98,21% | |
| Hoog zoutgehalte | 272.96 | 286.25 | 312.91 | 290.71 | 7,00% | 96.90% | |
| Hoge pH | 296.04 | 320.58 | 324.56 | 313.72 | 4,92% | 104,57% | |
| Lage pH | 314.77 | 327,89 | 340.26 | 327.64 | 3,89% | 109,21% |
Tabel 2 Basismonster Spiking Recovery
3.3 Precisie
3.3.1 Herhaalbaarheid
Herhaal de test 10 keer voor CHO DNA-standaarden bij een concentratie van 3 fg/μL met een CV <15%.
| Herhalingen | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Gemeen | CV% |
| Detectiewaarde (fg/μL) | 3.13 | 3.26 | 2.89 | 3.16 | 2,95 | 2.87 | 2.88 | 2,75 | 2.87 | 3.15 | 2,99 | 5,65% |
Tabel 3 Herhaalbaarheidsresultaten
3.3.2 Tussenliggende precisie
Drie experimentatoren testten onafhankelijk van elkaar CHO-DNA-standaardmonsters bij hoge en lage concentraties: 300 pg/μL, 3 pg/μL en 3 fg/μL. Voor elke concentratie werden drie replicaties uitgevoerd en de CV's van alle negen verkregen gegevens waren <15%.
| Uitgave |
Werkelijke concentratie Theoretische concentratie | CHO-DNA (3G) | ||
| 300 pg/uL | 3 pg/uL | 3 fg/uL | ||
| Uitgave 1 | Vastberadenheid 1 | 302.63 | 2.97 | 3.40 |
| Vastberadenheid 2 | 294.54 | 3.01 | 3.14 | |
| Vastberadenheid 3 | 287.67 | 2,99 | 3.01 | |
| Uitleg2 | Vastberadenheid 4 | 292.27 | 2.92 | 3.47 |
| Vastberadenheid 5 | 299.61 | 2.90 | 2.82 | |
| Vastberadenheid 6 | 305.73 | 2.93 | 2.90 | |
| Expeditie 3 | Vastberadenheid 7 | 301.06 | 3.17 | 3.15 |
| Vastberadenheid 8 | 299.17 | 3.00 | 3.21 | |
| Vastberadenheid 9 | 290.66 | 2.90 | 3.05 | |
| / | Gemeen | 297.04 | 2.98 | 3.13 |
| / | CV% | 2.03 | 2.80 | 6.85 |
Tabel 4 Resultaten tussenliggende precisie
3.4 Specificiteit
De interferentie van cellulair genomisch DNA dat gewoonlijk wordt gebruikt bij de productie van biologische producten werd beoordeeld op interferentie met CHO-DNA-detectiereagentia. De interferentiegroep overlapt de controlegroep en er werd geen interferentie waargenomen (de onderstaande afbeelding toont, in volgorde, de interferentiegegevens van muis-, MDCK-, HEK293- en E. coli-genomisch DNA met CHO-DNA-detectiereagentia).
Figuur 2 Resultaten van het interferentie-experiment
3.5 Kwantificeringslimiet
CHO DNA werd gedetecteerd bij 3 fg/μL, 1 fg/μL, 0,5 fg/μL, 0,3 fg/uL en 0,1 fg/μL, met 10 replicaties voor elke concentratie. De resultaten toonden aan dat de CV <20% was bij concentraties van 0,3 fg/μL en hoger. Dat wil zeggen dat de kwantificeringslimiet van de CHO host cell DNA residue detection kit (3G) 0,3 fg/μL was.
|
Herhalingen Testartikel | CHO-DNA (3G) (fg/μL) | |
| Hoeveelheid | Herberekeningsverhouding% | |
| 1 | 0,28 | 93,33% |
| 2 | 0,26 | 86,67% |
| 3 | 0,32 | 106,67% |
| 4 | 0,30 | 100,00% |
| 5 | 0,33 | 110,00% |
| 6 | 0,23 | 76,67% |
| 7 | 0,29 | 96,67% |
| 8 | 0,37 | 123,33% |
| 9 | 0,31 | 103.33% |
| 10 | 0,28 | 93,33% |
| Gemeen | 0,30 | / |
| CV% | 13,09% | / |
Figuur 3. CHO DNA (3G) qPCR-testresultaat
3.6 Detectielimiet
CHO DNA werd gedetecteerd bij 0,3 fg/μL, 0,1 fg/μL, 0,05 fg/μL en 0,01 fg/μL, met 20 replicaten voor elke concentratie. De resultaten toonden aan dat de detectiesnelheid ≥19 was (d.w.z. detectiesnelheid ≥95%) in 20 replicatenputjes bij concentraties van 0,05 fg/μL en hoger. Dat wil zeggen dat de detectielimiet van de CHO host cell DNA residue detection kit (3G) 0,05 fg/μL was.
Figuur 4. CHO DNA (3G) qPCR-testresultaat
3.7 Robuustheid
Deze kit is getest en geschikt voor, maar niet beperkt tot, de volgende instrumenten:
| Leverancier | Instrumentmodellen | Versterkingsrendementen | R2 | Kwantificeringslimiet | CV | Detectielimiet | Detectiepercentage |
| Thermisch | ABI 7500 | 99,69% | 1 | 0,3 fg/μL | 12,40% | 0,05 fg/μL | 95,65% |
| Thermisch | ABI QuantStudio5 | 99,26% | 1 | 0,3 fg/μL | 15,30% | 0,05 fg/μL | 100,00% |
| Roche | LichtCycler480 | 2,05% | 0,978 | 0,3 fg/μL | / | 0,05 fg/μL | / |
| Shanghai Hongshi | SLAN | 101,14% | 0,999 | 0,3 fg/μL | 14,41% | 0,05 fg/μL | 95,65% |
Tabel 5 Resultaten van de geschiktheidstest voor instrumenten
3.8 Stabiliteit
3.8.1 Vries-dooi stabiliteit
De CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) werd getest door herhaaldelijk 10 keer in te vriezen en te ontdooien, en de prestaties van de kit werden niet beïnvloed.
|
Testindicatoren Vries-dooi tijden | Parameter | T0 tijd | 10 keer invriezen en ontdooien |
| Standaard curveparameter | Versterkingsrendementen | 95,70% | 98,62% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Kwantificeringslimiet (0,3 fg/μL) | CV | 15,31% | 17,16% |
| Detectielimiet (0,05 fg/μL) | Detectiepercentage | 95,65% | 100% |
Tabel 6 Analyse van de resultaten van de vries-dooistabiliteit
3.7.2 Versnelde stabiliteit
CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) werden respectievelijk 30 dagen opgeslagen bij 2~8°C en 14 dagen bij 37°C. De prestaties van de kit werden niet beïnvloed.
|
Testindicatoren Versnelling Temperatuur & Tijd | Parameter | Experiment 1 | Experiment 2 | ||
| T0 tijd | 2~8℃ 30 Dagen | T0 tijd | 37℃ 14 Dagen | ||
| Standaard curveparameter | Versterkingsrendementen | 100,53% | 102,61% | 101,76% | 101,84% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Kwantificeringslimiet (0,3 fg/μL) | CV | 17,16% | 12,63% | 16,27% | 12.49 |
| Detectielimiet (0,05 fg/μL) | Detectiepercentage | 95,65% | 100% | 95,57% | 100% |
Tabel 7 Versnelde stabiliteitsresultaatanalyse
3.9 Limiet van blanco
3.9.1 Geen sjablooncontrole (NTC)
De DNA-verdunning zonder templatecontrole (NTC) met 96 herhalingen om een kwantitatieve qPCR-test uit te voeren, was bij alle CT-waarden boven de 96 geteste replicaatputjes >40.
Figuur 5 Resultaten van het NTC-experiment
3.9.2 Negatief extractiecontrolemonster (NCS)
Het negatieve extractiecontrolemonster (NCS) was de DNA-verdunning en werd eerst geëxtraheerd door middel van voorbehandeling van het monster. Vervolgens werd qPCR uitgevoerd. Alle CT-waarden boven de 48 geteste replicaatputjes waren >40.
Figuur 6 NCS experimentele resultaten
- 4.Referentie
4.1 Chinese Farmacopee Commissie (ChPC). Farmacopee van de Volksrepubliek China (Vol Ⅲ) [S]. Beijing：China Medical Science and Technology Press，p.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Algemene principes voor technische beoordeling van analytische methodevalidatie voor kwaliteitscontrole van biologische producten.
4.3 ICH(2022)《Analytische methodevalidatie Q2》, conceptversie.
Bestel Informatie
| Beschrijving | Onderdeelnummer |
| 41332ES | |
| 41331ES | |
| 41307ES | |
| 41308ES | |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-detectiekit (2G) | 40619ES |