대장균 숙주 세포 DNA 잔류물 검출 키트(2G) 검증 보고서

대장균 숙주세포 DNA 잔류물 검출 키트 ( 2G )

자격 요약 (Cat No.: 4 1308 ES60)

1. 배경

이 보고서에 요약된 데이터는 Yeasen Biotechnology에서 'E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit(2G)' 제품을 위해 수행한 것입니다. 요약 데이터는 사용자의 참조용일 뿐이며, 사용자는 자신의 샘플을 사용하여 숙주 세포 잔류물 DNA 방법을 검증하여 해당 방법이 사용자 요구 사항을 충족하는지 확인해야 합니다. 이 키트를 사용하는 모든 실험실은 다음 매개변수를 검증하는 것이 좋습니다. 선형성, 범위, 정확도, 정밀도, 정량 한계, 특이성 및 견고성.

Yeasen Biotechnology는 이 키트에 대한 자세한 자격 보고서를 제공할 수 있습니다. 사용자가 이 보고서를 사용하는 경우 적합성(정밀도, 정확도 및 특이성 포함)만 검증해야 합니다.

2. 실험재료 및 방법

2.1 E.coli 숙주 세포 DNA 잔류물 검출 키트(2G), 공급업체: Yeasen, 카탈로그 번호: 41308ES60.

2.2 MolPure® 자기 잔류 DNA 샘플 준비 키트, 공급업체: Yeasen, 카탈로그 번호: 18461ES60.

2.3 대장균 DNA 함량에 대한 국가 표준: Cat. 270027, Lot No.: 201101, 농도: 96.2 μg/mL, 보관 조건: -70℃, 구매처: 국립식품의약품안전처.

2.4 원본 데이터: 전자 버전은 상위 파일 'E.coli 숙주 세포 DNA 잔류물 검출 키트(2G)'의 하위 파일인 '실험 보고서'에 기록되었습니다.

2.5 방법: 실험에 사용된 재료와 조작 방법은 기본적으로 Yeasen Biotechnology에서 생산 또는 설정하였으며, 장기간 평가 및 검증을 거쳤으며, 키트 개발 및 제조는 ISO 13485 시스템을 따릅니다.

3. 자격내용 및 결과

3.1 감지범위

이 키트의 선형 범위는 R ² =1일 때 30 fg/μL~300 pg/μL이고, 증폭 효율은 각 농도 분석에 대해 CV<15%로 101.74%였습니다.

그림 1 E.coli DNA (2G) qPCR 표준 곡선

3.2 정확도

3. 2 .1 대장균 DNA 함량에 대한 국가 표준 과의 편차

키트의 각 배치에 있는 E.coli DNA 기준 물질은 E.coli DNA 함량에 대한 국가 표준을 사용하여 교정되었습니다. Yeasen DNA 기준 물질은 E.coli DNA 함량 교정 곡선에 대한 국가 표준에서 기본적으로 편차가 없었고, 검정 값의 편차는 <5%였습니다.

3. 2. 2​ 회복​

3.2.2.1 빈 샘플 스파이킹 회수 실험

고농도 및 저농도(각각 300 pg/μL, 3 pg/μL 및 30 fg/μL)의 대장균 DNA 표준 시료를 준비하고, 잔류 DNA 시료 전처리 키트를 위한 자기 비드 방법을 사용하여 추출 후 분석했습니다(각 시료에 대해 2번의 추출 반복을 수행하고, 각 추출물에 대해 3번의 분석 반복을 수행했습니다). 그리고 시료 회수율 및 변이계수(CV)를 분석했습니다.

DNA 샘플의 농도에 따라 회수율은 70%~130% 범위였고, CV는 모두 20% 미만이었습니다.

샘플 유형	이론적 농도	1개의 평균을 추출합니다	2개의 평균을 추출하다	평균 농도	이력서	회복
빈 샘플	/	/	/	/	/	/
복구 샘플 1	300pg/μL	250.56pg/μL	262.11pg/μL	256.33pg/μL	4.41%	85.44%
복구 샘플 2	3pg/μL	2.29pg/μL	2.56pg/μL	2.42pg/μL	7.09%	80.77%
복구 샘플 3	30fg/μL	33.62fg/μL	32.61fg/μL	33.12fg/μL	14.28%	110.39%

표1 빈 샘플 스파이킹 회수

3.2.2.2 시뮬레이션 샘플 스파이킹 복구 실험

동일한 농도(3 pg/μL의 E.coli DNA)의 샘플을 추출(각 샘플에 대해 2번의 추출 반복을 수행하고 각 추출물에 대해 3번의 분석 반복을 수행)하고 5가지 다른 배경 용액(고단백질, 고핵산, 고 및 저 pH, 고염)과 샘플 회수율 및 변이계수를 분석했습니다.

다양한 배경 솔루션에 대한 DNA 샘플 회수율은 70%에서 130% 사이였고, 모든 CV는 20% 미만이었습니다.

샘플 유형	이론적 집중	1개의 평균을 추출합니다	2개의 평균을 추출하다	평균 농도	이력서	회복
기본 샘플	/	/	/	/	/	/
고단백질	3pg/μL	2.25	2.23	2.24	1.09%	74.74%
고핵산		3.93	3.96	3.95	1.56%	131.52%
고염		2.69	2.67	2.68	2.63	89.20%
높은 pH		2.90	3.67	3.29	13.82%	109.55%
낮은 pH		2.77	2.87	2.82	3.41%	94.01%

표2 기본 샘플 스파이킹 복구

3.3 정밀도

3. 3.1 반복성​

CV <15%로 3 pg/μL의 농도에서 E.coli DNA 표준에 대해 분석을 10번 반복합니다.

반복	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	평균	이력서
검출값(fg/μL)	3.16	2.87	2.97	2.86	2.81	2.97	3.14	3.21	3.14	3.1	3.02	4.78%

표3 반복성 결과

3. 3. 2​ 중간 정밀도

3명의 실험자가 높고 낮은 농도(300 pg/μL, 3 pg/μL, 30 fg/μL)에서 E.coli DNA 표준 시료를 독립적으로 테스트했으며, 각 농도에 대해 3회 반복 실험했으며, 얻은 9개 데이터의 변이계수는 모두 15% 미만이었습니다.

경험치	실제 농도 이론적 집중	대장균 DNA(2G)
		300pg/uL	3pg/uL	30fg/uL
경험치 1	결의 1	295.65	3.22	26.90
	결의 2	287.71	3.24	32.00
	결의 3	300.23	3.17	27.50
경험치 2	결의 4	306.06	3.13	37.30
	결의 5	299.76	3.02	32.70
	결의 6	299.63	3.02	34.00
경험치 3	결의 7	266.70	3.01	35.90
	결의 8	272.89	3.09	40.70
	결의 9	276.51	3.01	35.20
/	평균	289.46	3.10	33.60
/	이력서	4.89%	3.02%	13.18%

표4 중간 정밀도 결과

3.4 특이성

생물학적 제제 생산에 일반적으로 사용되는 세포 유전체 DNA의 간섭을 E.coli DNA 검출 시약으로 간섭하는지 평가한 결과, 간섭군이 대조군과 겹치고 간섭이 나타나지 않았습니다(아래 그림은 HEK293, Vero, CHO 유전체 DNA와 E.coli DNA 검출 시약의 간섭 데이터를 순서대로 보여줍니다).

그림 2 간섭 실험 결과

3.5 정량 한계

E.coli DNA는 50 fg/μL, 40 fg/μL, 30 fg/μL, 10 fg/μL, 5 fg/μL에서 검출되었으며, 각 농도에 대해 10회 반복되었습니다. 결과는 CV가 30 fg/μL 이상의 농도에서 <20%임을 보여주었습니다. 즉, E.coli 숙주 세포 DNA 잔류물 검출 키트(2G)의 정량 한계는 30 fg/μL였습니다.

반복 테스트 항목	대장균 DNA(2G)(fg/μL)
	수량	재계산 비율
1	29.43	98.09%
2	29.51	98.35%
3	32.04	106.79%
4	26.07	86.89%
5	34.06	113.53%
6	33.54	111.79%
7	26.95	89.82%
8	27.38	91.26%
9	27.04	90.13%
10	26.10	87.02%
평균	29.21	/
이력서	10.40%	/

그림 3 30fg/μL E.coli DNA (2G) qPCR 검사 결과

3.6 견고성

이 키트는 테스트를 거쳤으며 다음 기기에 적합하지만 이에 국한되지는 않습니다.

공급업체	계기 모델	증폭 효율	알 2	정량 한계(fg/μL)	이력서
열	에이비비7500	101.74%	1	30	13.30%
열	ABI 퀀트스튜디오5	100.46%	1	30	12.40%
바이오라드	CFX96	99.20%	0.999	30	13.76%
상하이 홍시	슬랜	100.40%	0.999	30	11.67%

표5 기기적합성 시험 결과

3.7 안정성

3. 7 .1 동결-융해 안정성

E.coli 숙주세포 DNA 잔류물 검출 키트(2G)는 10회 반복적인 동결 및 해동을 통해 테스트 되었으며, 키트의 성능에 영향을 미치지 않았습니다.

테스트 지표 동결-해동 시간	매개변수	T0 시간	동결-해동 10회
표준 곡선 매개변수	증폭 효율	98.23%	100.20%
	알 2	1	0.999
정량 한계(30 fg/μL)	이력서	15.07%	9.66%

Table6 동결융해 안정성 결과 분석

3. 7. 2​ 가속된 안정성

E.coli 숙주 세포 DNA 잔류물 검출 키트(2G)는 각각 2~8°C에서 30일, 37°C에서 14일 동안 보관되었습니다. 키트 성능에는 영향이 없었습니다.

테스트 지표 가속 온도 및 시간	매개변수	실험 1		실험 2
		T0 시간	2~8℃ 30일	T0 시간	37℃ 14일
표준 곡선 매개변수	증폭 효율	97.77%	99.81%	98.39%	98.65%
	알 2	1	1	1	1
정량 한계(30 fg/μL)	이력서	11.04%	13.79%	9.55%	14.55%

Table7 가속안정성 결과 분석

4. 4 . 참조

4.1 중국 약전위원회(ChPC). 중화인민공화국 약전(Vol III) [S]. 베이징: 중국의학과학기술출판사, p.542-543, 2020.

4.2 NMPA, 2007: 생물학적 제품의 품질 관리를 위한 분석 방법 검증의 기술적 검토를 위한 일반 원칙.

4.3 ICH(2022) 《분석방법 검증 Q2》, 초안 버전.

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