mRNA를 세포 내로 형질감염시키기 위한 프로토콜

1. 실험 재료

2. 실험 절차

1) 형질감염 1일 전 준비

  • HEK293 세포를 6웰 플레이트에 접종하여 형질전환 당일에 밀도가 70~90%에 도달하도록 합니다.
  • 각 웰당 2mL의 완전 DMEM(10% FBS 포함)을 사용하세요.
  • 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 배양

2) mRNA-시약 복합체 준비(6-well 플레이트의 well당)

  • mRNA 희석: 100 μL Opti-MEM에 2.5 μg EGFP mRNA를 희석합니다.

[참고]: 정확한 피펫팅을 위해서는 mRNA 농도가 > 0.1 μg/μL이어야 합니다.

  • 희석된 형질전환 시약: 별도의 튜브에 5 μL 형질전환 시약을 100 μL Opti-MEM에 희석합니다.
  • mRNA-트랜스펙션 시약 복합체 형성: 두 용액을 합치고 부드럽게 섞은 후, 실온에서 10~15분 동안 배양합니다.

플레이트 형식

웰당 mRNA 양

트랜스펙션 시약 용량

총 복합 부피(Opti-MEM 또는 무혈청 배지)

6웰 플레이트

2~3μg

4~6 μL

200 μL

24웰 플레이트

500~800ng

1.5–2 μL

50 μL

96웰 플레이트

100~200ng

0.3~0.5 μL

20 μL

3) 세포 형질 전환: 세포에 추가

  • 웰에서 오래된 배양 배지를 제거하고 1.8 mL의 신선한 완전 DMEM으로 교체합니다.
  • 200 μL mRNA-시약 복합체를 웰에 한 방울씩 떨어뜨립니다.
  • 접시를 살짝 흔들어 재료를 고르게 분산시킵니다.

4) 형질감염 후 취급

  • 세포를 37 °C, 5% CO₂에서 배양합니다.
  • 형광현미경을 사용하여 형질감염 후 18~24시간에 EGFP 발현을 관찰합니다.
  • 세포독성이 관찰되지 않는 한 배지를 교체할 필요가 없습니다.

팁 및 참고 사항

  • mRNA의 순도가 높은지 확인하세요(DNase 처리, A260/A280 ~2.0).
  • mRNA 스톡의 반복적인 동결-해동 주기를 피하세요.
  • 이 프로토콜은 볼륨을 적절히 조절하여 다른 플레이트 형식(예: 24웰 또는 96웰)에 맞게 조정할 수 있습니다.

3. 실험 결과

1) HEK293 세포에서의 효율적인 mRNA 전달

그림 1. 6-웰 플레이트에서 5μL 형질전환 시약을 사용하여 2.5μg EGFP mRNA(~1000bp)를 형질전환한 결과, 높은 형질전환 효율을 나타냄. 

그림 1. 6-웰 플레이트에서 5 μL 형질 전환 시약을 사용하여 2.5 μg EGFP mRNA(~1000 bp)를 형질전환한 결과, 높은 형질전환 효율을 나타냄.

2) 다양한 세포 유형에 효율적인 mRNA 전달

그림 2. 여러 세포주에서의 mRNA 형질감염 성능

 그림 2. 여러 세포주에서의 mRNA 형질 감염 성능

Booster DNA&RNA Transfection Reagent를 사용하여 다양한 세포에 mRNA를 transfection한 결과, T 브랜드 L*3000과 비교 분석했습니다. 이 결과는 Booster의 mRNA transfection 효율이 더 우수함을 보여줍니다.

4. 고객 피드백

1) 고효율 293T mRNA 형질감염

그림 3. mRNA 형질감염 성능

그림 3. mRNA 형질감염 성능

2) 고효율 HTC116 mRNA 형질감염

그림 4. Booster DNA&RNA Transfection Reagent를 사용한 mRNA transfection과 T 브랜드 L*3000을 사용한 mRNA transfection 비교. 이 결과는 Booster의 mRNA transfection 효율이 우수함을 보여줍니다.

그림 4. Booster DNA&RNA Transfection Reagent와 T 브랜드 L*3000을 사용한 mRNA transfection 결과. 이 결과는 Booster의 mRNA transfection 효율이 우수함을 보여줍니다.

4. 자주 묻는 질문(FAQ) 및 솔루션

Q1: mRNA 형질감염을 위한 최적의 밀도는 얼마입니까?

답변: 최적의 흡수와 세포 건강을 보장하기 위해서는 형질 전환 시점에 세포가 70%~90% 합류되어야 합니다.

Q2: 형질감염 중에 혈청이 포함된 배지를 사용할 수 있나요?

A: Hieff Trans™ Booster를 포함한 대부분의 폴리머 기반 형질감염 시약은 혈청과 호환됩니다. 하지만 복합체 형성 중에는 혈청을 피하고, 이 단계에서는 무혈청 배지(예: Opti-MEM)를 사용하십시오.

Q3: mRNA 스톡의 농도는 어떻게 해야 하나요?

A: mRNA 농도는 최소 100 ng/μL 이상이어야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 피펫팅 오류를 최소화하기 위해 ≥ 0.5 μg/μL를 사용하십시오.

Q4: 웰당 얼마나 많은 mRNA를 사용해야 합니까?

A: 6-well 플레이트의 경우, 웰당 2~3μg mRNA를 권장합니다. 다른 형태(예: 24-well의 경우 약 500~800ng)의 경우, 이에 맞게 조절하세요.

질문 5: 형질감염 후 얼마나 빨리 단백질 발현을 검출할 수 있나요?

A: EGFP 발현은 일반적으로 형질감염 후 6~12시간 후에 관찰되며, 24~48시간에 가장 높은 발현을 보입니다.

Q6: 형질전환 효율이 낮으면 어떻게 해야 하나요?

A: 세포가 건강하고 적절한 밀집도를 갖추고 있는지 확인하세요.

  • mRNA 품질 확인: A260/A280 ~2.0, RNA 손상 없음(분해 없음), 5' 캡과 3' 폴리(A) 꼬리 모두 존재. 적정 범위 내에서 mRNA 사용량을 증가시킨다.
  • mRNA/시약 비율 최적화: 최적의 성능을 위해 mRNA/시약 비율을 1:3~1:5 사이로 조정하세요.
  • 복합체의 배양 시간을 조절하세요 : 응집을 방지하기 위해 복합체를 5~10분 동안 배양하세요.
  • 검출 시간 최적화: 발현 피크는 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 6~24시간 이내이지만 최대 48시간까지 연장된 검출이 필요할 수 있습니다.

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애플리케이션

이름

카탈로그 번호

크기

DNA, siRNA, miRNA, mRNA, ASO 등과 호환됩니다.

일차세포에서 의 성공이 입증되었습니다 .

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