1. 실험 재료
- HEK293 세포: 형질 전환 시점에 세포 밀도가 30%~50%에 도달해야 합니다.
- siRNA: 타겟 특정 또는 제어 siRNA(농도 ≥ 10 μM)
- Hieff Trans TM 부스터 DNA&RNA 트랜스펙션 시약(카탈로그 번호 40801)
- 배양배지 : 완전배지(혈청 및 항생제 함유)
- 혈청 무함유 배지(예: Opti-MEM® I 저혈청 배지)
[참고]: 혈청이 없는 배지는 복합 제제를 위한 siRNA와 형질전환 시약을 희석하는 데 사용됩니다.
기타 자료: 멸균 원심분리관 , 마이크로피펫 및 멸균 피펫 팁 , CO₂ 인큐베이터 , 원심분리기 .
2. 실험 절차
1) 형질감염 1일 전 준비
- HEK293 세포를 24 웰 플레이트에 접종하여 형질전환 당일에 밀도가 30%~50%에 도달하도록 합니다.
- 각 웰당 0.5-1 mL의 완전 DMEM(10% FBS 포함)을 사용합니다 .
- 37 °C, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 배양합니다.
[참고]: 24-웰 플레이트의 경우, 웰당 0.5~1mL의 세포 현탁액을 분주합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 고르게 분포되도록 합니다.
2) si RNA-Reagent Complex 준비 (6-well plate의 well당)
- si RNA 희석 : 5 0 μL Opti-MEM 에 siRNA의 최종 농도 50 nM을 희석합니다 .
[참고]: siRNA 스톡은 일반적으로 10~20 μM으로 준비됩니다.
- 희석된 형질전환 시약: 별도의 튜브에 1.5-2 μL 형질전환 시약을 50 μL Opti-MEM에 희석합니다.
- si RNA-Transfection Reagent Complex를 형성합니다 . 두 용액을 합하고 부드럽게 섞은 후 실온에서 10~15분 동안 배양합니다.
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플레이트 형식 |
웰당 최종 siRNA |
트랜스펙션 시약 용량 |
총 복합 부피(Opti-MEM 또는 무혈청 배지) |
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6웰 플레이트 |
50~100nM |
4~6 μL |
200 μL |
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24웰 플레이트 |
10~50nM |
1.5–2 μL |
50 μL |
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96웰 플레이트 |
10~30nM |
0.3~0.5 μL |
20 μL |
3) 세포 형질 전환: 세포에 추가
- 웰에서 오래된 배양 배지를 제거하고 0.5-1 mL의 신선한 완전 DMEM (혈청 함유, 항생제 없음) 으로 교체합니다 .
- 1 00 μL si RNA-시약 복합체를 웰에 한 방울씩 떨어 뜨립니다 .
- 접시를 살짝 흔들어 재료를 고르게 분산시킵니다.
4) 형질감염 후 취급
- 세포를 37 °C, 5% CO₂에서 배양합니다.
- 표적 유전자와 세포 유형에 따라 형질 전환 후 24~72시간에 유전자 녹아웃을 분석합니다.
- 세포독성이 관찰되지 않는 한 배지를 교체할 필요는 없습니다.
[참고]: 시간 지점은 대상에 따라 다릅니다. 일반적으로 qPCR은 24~48시간 후 , 단백질 노크다운은 형질감염 후 48~72시간 후에 이루어집니다 .
3. 실험 결과
1. 다양한 세포 유형에 효율적인 si RNA 전달
그림 1. Booster DNA&RNA Transfection Reagent를 사용하여 다양한 세포에 siRNA를 transfection한 결과와 T 브랜드 L*3000을 비교한 결과입니다. 이 결과는 Booster의 siRNA transfection 효율이 우수함을 보여줍니다 .
4. 자주 묻는 질문(FAQ) 및 솔루션
질문 1: siRNA 형질감염을 위한 최적의 밀도는 얼마입니까?
A: 효율적인 흡수를 보장하고 세포 생존력을 유지하기 위해, 형질 전환 시점에 세포의 밀도가 30~50%에 도달해야 합니다.
Q2: 형질감염 중에 혈청이 포함된 배지를 사용할 수 있나요?
A: Hieff Trans™ siRNA Reagent를 포함한 대부분의 폴리머 기반 형질감염 시약은 혈청과 호환됩니다. 단, 최적의 복합체 형성을 위해 복합체 형성 중에는 무혈청 배지(예: Opti-MEM)를 사용하십시오.
Q3: siRNA 스톡의 농도는 어떻게 해야 합니까?
A: siRNA 스톡 농도는 일반적으로 10~20 μM입니다. 형질감염 반응에서 최종 농도가 10~50 nM이 되도록 적절히 희석하십시오.
Q4: 웰당 얼마나 많은 siRNA를 사용해야 합니까?
A: 24-well 플레이트의 경우, 웰당 최종 siRNA 농도는 10~50 nM이 권장됩니다. 다른 플레이트의 경우 용량을 적절히 조절하십시오.
Q5: 형질전환 후 유전자 녹다운을 언제 감지할 수 있나요?
A: mRNA 노크다운은 일반적으로 형질감염 후 24~48시간에 검출될 수 있으며, 단백질 노크다운은 종종 48~72시간 사이에 관찰됩니다.
Q6: 형질전환 효율이 낮으면 어떻게 해야 하나요?
에이:
- 세포가 건강하고 권장되는 밀도(30%~50%)에 도달했는지 확인하세요.
- siRNA의 무결성과 서열 특이성을 확인하고, siRNA가 분해되는 것을 방지합니다.
- 권장 범위 내에서 siRNA와 시약의 비율을 최적화합니다(예: 24웰 형식에서 웰당 1.5~2 μL 시약과 함께 10~50 nM siRNA).
- siRNA-시약 복합체의 배양 시간을 조절합니다. 안정된 복합체를 형성할 때까지 실온에서 10~15분 동안 배양합니다.
- 세포 유형과 유전자 표적에 따라 녹다운 동역학이 다르므로 감지 시간을 최적화합니다.
참고사항: 세포독성을 최소화하기 위해 형질전환 후에는 신선한 완전배지를 사용하고 형질전환 기간 동안 항생제 사용을 피하세요.
5. 관련 제품
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애플리케이션 |
이름 |
카탈로그 번호 |
크기 |
|
DNA, siRNA, miRNA, mRNA, ASO 등과 호환됩니다. 일차세포에서 의 성공이 입증되었습니다 . |
40801 |
100 μL/1.5 mL |
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