TUNEL 염색에 대해 얼마나 알고 계신가요? 비정상적인 염색 결과에 대한 문제 해결 가이드

세포자멸사 과정에서 활성화된 엔도뉴클레아제는 뉴클레오솜 사이에서 유전체 DNA를 절단합니다. 일반적으로 사용되는 TUNEL 분석법(TdT-매개 dUTP 닉 엔드 라벨링)은 세포자멸사 후기 단계에서 핵 내 DNA 단편화를 검출합니다.

이 원리는 단편화된 DNA의 3'-하이드록실 말단을 형광 표지된 dUTP로 표시하는 것으로, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)의 촉매 작용을 받아 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

Q1: TUNEL 분석에서 일반적인 검출 방법은 무엇입니까?

TUNEL 감지에는 두 가지 일반적인 방법이 있습니다(아래 표 참조):

첫 번째 방법은 TdT를 사용하여 형광으로 표시된 dUTP를 3'-OH 끝의 DNA 절단에 통합하고 형광은 형광 또는 공초점 현미경(예: FITC 표시)을 사용하여 직접 관찰합니다.

두 번째 방법은 TdT를 이용하여 바이오틴 또는 디곡시제닌으로 표지된 dUTP를 도입한 후, HRP가 결합된 스트렙타비딘 또는 항디곡시제닌 항체로 검출하는 것입니다. 발색 기질(예: DAB)은 광학 현미경으로 관찰 가능한 갈색 침전물을 생성합니다.

검출 방법	상표	탐지 장비	샘플 유형	형질
형광	플루오레세인-dUTP	형광현미경	조직 절편, 세포 샘플	높은 감도; 빛에 민감함
발색성	비오틴/디곡시게닌-dUTP + DAB	광학 현미경	조직 절편	안정적인 신호; 3% H₂O₂를 사용한 내인성 과산화효소 차단이 필요합니다.

Q2: TUNEL 검사에서 양성 신호가 나오지 않는 이유는 무엇입니까?

양성 신호가 부족한 것은 샘플 내 DNA 분해, 검출 시약 내 TdT 효소 불활성화, 형광 dUTP 분해, 투과성 부족 또는 과도한 세척으로 인해 발생할 수 있습니다.

추천사항:

샘플 무결성과 분석 기능을 확인하기 위해 양성 대조군(예: DNase I 처리 샘플)을 포함합니다.
시약의 유효성을 확인하고 만료된 제품은 사용하지 마세요.
Proteinase K 농도(일반적으로 10~20 μg/mL)를 최적화하고 실온에서 15~30분 동안 배양합니다.
세탁 횟수와 시간을 줄이세요. 세탁 단계 중에는 셰이커를 사용하지 마세요.

Q3: 핵 밖에서는 비특이적 염색이 일어나는 이유는 무엇입니까?

비세포사멸 영역의 비특이적 염색(핵 염색과 겹치지 않음)은 다음과 같은 원인으로 발생할 수 있습니다.

괴사세포의 무작위 DNA 단편화,
조직 자가분해,
과도한 TdT 또는 형광 dUTP 농도, 또는 지연된 반응 시간.

완화 전략:

TUNEL을 H&E 염색과 같은 형태학적 방법과 결합하여 핵 응축과 세포 사멸체를 식별함으로써 세포 사멸과 괴사를 구별합니다.
처리 시간을 최소화하고 신선한 티슈를 신속하게 고정합니다.
TdT와 표지된 dUTP의 농도를 낮추거나 반응 시간을 줄여 비특이적 신호를 줄입니다.

Q4: 형광 검출 시 배경값이 높은 이유는 무엇인가요? 어떻게 개선할 수 있을까요?

높은 배경 잡음의 일반적인 원인은 다음과 같습니다.

감지하려면 강한 노출이 필요한 약한 양성 신호
적혈구의 헤모글로빈으로부터의 자가형광(조직 샘플에서) 또는 마이코플라스마 오염(세포 샘플에서)
세척이 부적절함.

해결책:

문제가 샘플 관련인지 시스템 관련인지 식별하기 위해 DNase I 처리한 양성 대조군을 포함합니다.
자가형광을 확인하려면 형광 채널 아래의 공조직 절편을 확인하십시오. 자가형광이 있는 경우, 소광제를 사용하거나 자가형광 스펙트럼과 겹치지 않는 형광단을 선택하십시오.
마이코플라스마 오염의 경우, 불규칙하거나 점상적인 세포외 형광을 살펴보고 그에 따라 검출/제거를 실시합니다.
배경 형광을 줄이기 위해 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS를 사용하여 세척을 개선합니다.

Q5: 조직 형태 손상은 TUNEL 검사 결과에 어떤 영향을 미칩니까?

과도한 고정은 조직 취약성과 비정상적인 염색을 초래할 수 있습니다. 고정 시간은 24시간 이내로 하는 것이 좋습니다. 단백질 분해효소 K를 과도하게 사용하면 세포 구조가 손상되어 비정상적인 염색 패턴이 나타날 수 있습니다.

Q6: TUNEL 염색을 면역형광 검사와 병행할 수 있나요? 가능하다면 권장 순서는 무엇인가요?

네, TUNEL 염색은 면역형광 검사와 병행할 수 있습니다. TUNEL 염색을 먼저 시행한 후 면역형광 검사를 시행하는 것이 좋습니다.

Q7: 염색된 세포와 조직 샘플을 마운팅할 수 있나요? 얼마나 오랫동안 보관할 수 있나요?

염색된 세포 샘플의 형광 신호는 일반적으로 1~2일 동안 지속됩니다. 조직 절편은 중성 발삼으로 고정할 수 있으며, 형광은 며칠에서 몇 주 동안 검출 가능할 수 있습니다. 발색 신호는 더 오래 보존될 수 있습니다.

Q8: 염색 후 결과를 어떻게 분석해야 합니까?

TUNEL 양성 세포의 비율을 두 그룹 간에 비교하여 세포사멸을 분석합니다.
세포사멸률 = TUNEL 양성 세포 / 총 세포 수(DAPI 또는 PI 염색).

그림 1: 소베티롬은 소기도 상피세포(SAEC)에서 블레오마이신 유도 세포사멸을 감소시킵니다.

[참고]: TUNEL 염색은 (A) SV군, (B) SS군, (C) BV군, (D) BS군의 SAECs에서 수행되었습니다. 파란색은 DAPI로 염색된 핵을, 녹색은 TUNEL 염색에 양성 반응을 보인 세포사멸 세포를 나타냅니다. 스케일 바: 100 µm. 화살표는 TUNEL 양성 세포를 나타냅니다. (E) TUNEL 양성 세포 비율 정량화.

이것으로 TUNEL 염색에서 흔히 발생하는 문제에 대한 설명을 마칩니다. 이 가이드가 신입 연구자들이 유사한 문제를 효과적으로 해결하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 적절한 도구와 방법을 사용하면 작업 효율을 훨씬 높일 수 있습니다. 모든 연구자들의 성공과 아름다운 염색 결과를 기원합니다!

참고문헌

1. Li Z, Zhang X, Xie S 외. H3K36me2 메틸전이효소 NSD2는 정자 형성 과정에서 후성유전학적 재프로그래밍을 조절한다 [2022년 6월 23일 인쇄 전 온라인 게재]. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):6786–6800. doi:10.1093/nar/gkac533 (IF: 16.971)

제품명	사양	카탈로그 번호
TUNEL 세포사멸 검출 키트(FITC)	20T/50T/100T	40306ES20/50/60
TUNEL 세포사멸 검출 키트(Alexa Fluor 488)	20T/50T/100T	40307ES20/50/60
TUNEL 세포사멸 검출 키트(Alexa Fluor 640)	20T/50T/100T	40308ES20/50/60