활성산소종(ROS)은 세포 대사 과정에서 생성되는 산소 함유 부산물입니다. 생리적 조건에서 ROS 수치는 엄격하게 조절되며, 정상적인 세포 신호 전달, 세포 주기 진행, 유전자 발현 및 항상성 유지에 있어 신호 전달 분자 역할을 합니다. 그러나 고농도의 ROS는 산화 스트레스를 유발하여 DNA, 세포막 지질, 단백질과 같은 세포 거대분자를 손상시킵니다. 이러한 산화적 손상은 세포자멸사를 유발할 수 있으며, 노화, 암, 신경퇴행성 질환, 당뇨병, 염증과도 관련이 있습니다.
Q1: 활성 산소종(ROS)이란 무엇인가요? 어떤 종류가 있나요?
ROS는 과산화물, 초과산화물, 히드록실 라디칼, 싱글렛 산소, α-산소 종을 포함하여 생물체의 산소 대사와 관련된 산소 함유 자유 라디칼과 과산화물을 말합니다.
예로는 초산화물 음이온(O₂⁻), 과산화수소(H₂O₂), 히드록실 라디칼(·OH), 차아염소산(HOCl), 과산질소산염 음이온(ONOO⁻), 일산화질소(NO) 등이 있습니다.
Q2: ROS를 검출하는 방법은 무엇입니까?
ROS 감지 방법은 직접적 접근 방식과 간접적 접근 방식으로 나눌 수 있습니다.
① 직접 검출은 일반적으로 특정 형광 프로브를 사용합니다.
② 간접 검출에는 지질, 단백질 또는 DNA의 손상을 측정하는 것이 포함됩니다.
③ 혹은 항산화 수치와 관련 효소 활동을 검출하는 방법도 사용될 수 있다.
Q3: ROS를 직접 감지하는 데 일반적으로 사용되는 프로브는 무엇입니까?
주요 유형은 5가지입니다.
- 총 ROS – DCFH-DA(H₂DCFDA), 녹색 형광
- 총 ROS – CellROX Orange, 주황색 형광
- 슈퍼옥사이드 음이온 – DHE, 적색 형광
- 미토콘드리아 ROS – MitoSOX, 적색 형광
- 일산화질소(NO) – DAF-2 DA, 녹색 형광
질문 4: DCFH-DA를 박테리아, 균류 또는 식물에 사용할 수 있나요?
DCFH-DA는 항체와 달리 종 특이적이지 않습니다. 또한, 분자량이 작기 때문에 대장균 에서 활성 산소(ROS) 검출에 사용하는 것이 문헌에서 검증되었습니다.
Q5: DCFH-DA로 검출했을 때 양성 신호가 나오지 않으면 어떻게 해야 하나요?
DCFH-DA를 사용하여 ROS를 감지했을 때 대조군에 비해 유의미한 양성 신호나 양성 세포 집단이 관찰되지 않으면 다음과 같은 문제 해결 사항을 고려하세요.
양성 대조군의 존재와 결과를 확인하세요.
총 ROS에 대한 일반적인 양성 대조군에는 과산화수소(H₂O₂), tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(TBHP), 안티마이신 A(AMA), 피오시아닌이 포함됩니다.
예를 들어, 그림 A에서 피오시아닌은 Huh7 세포의 양성 대조군으로 사용되었습니다. ROS(DCF)와 superoxide(DHE) 신호가 모두 증가했습니다[1].
DCFH-DA의 작업 농도와 배양 조건을 확인하세요.
DCFH-DA의 작동 농도가 낮으면 신호가 약해질 수 있습니다. 농도를 1 μM에서 2 μM 또는 4 μM으로 높일 수 있습니다. 일반적인 배양 조건은 37°C에서 30분입니다.
[메모]: 희석 완충액은 PBS, HBSS 또는 무혈청 배지일 수 있습니다.
세포 기반 분석을 위한 샘플 처리.
DCFH-DA, DHE 또는 MitoSOX Red를 사용하든 이러한 프로브는 생세포 검출을 위해 설계되었습니다.
샘플을 고정하지 마십시오 . 또한, 염색 후 퇴색 방지 장착 매체를 사용하거나 커버슬립을 하지 마십시오 .
DCFH-DA 염색 원리 : 비형광 DCFH-DA는 세포막을 자유롭게 투과하여 세포 내 에스테라제에 의해 가수분해되어 비형광 DCFH를 형성합니다. 활성산소(ROS)가 존재하면 DCFH는 형광 DCF로 산화되며, 녹색 형광 강도는 ROS 농도와 상관관계를 보입니다.
Q6: 적합한 양성 대조군은 어떻게 선택합니까?
양성 대조군은 연구 대상 활성산소(ROS)의 종류에 따라 다릅니다. MitoSOX의 경우, 양성 대조군은 MitoPQ이고 음성 대조군은 DETA NONOate입니다.
표 1: ROS 검출을 위한 양성 및 음성 대조군
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ROS 유형 |
양성 대조군 |
음성 대조군 |
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총 ROS |
TBHP(tert-부틸 히드로퍼옥사이드), H₂O₂ |
– |
|
ROS; 슈퍼옥사이드 |
AMA(항마이신 A) |
– |
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슈퍼옥사이드; 과산화수소 |
피오시아닌 |
– |
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일산화질소 |
LPS(지질다당류) |
– |
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미토콘드리아 슈퍼옥사이드 |
미토피큐 |
데타 노노에이트 |
Q7: 핵을 염색해야 하는 경우 어떤 핵 염색약을 사용해야 합니까?
생세포 이미징에는 막 투과성이 뛰어난 Hoechst 33342가 권장됩니다. DAPI도 핵염료이지만, 생세포 이미징에는 Hoechst가 더 적합합니다. 두 제품 모두 청색 형광을 방출합니다.
Q8: 검출 결과는 어떻게 분석해야 합니까?
결과는 여러 실험군에서 ROS의 평균 형광 강도를 비교하여 분석할 수 있습니다. 또한, 비교 분석을 위해 ROS 양성 세포 비율을 계산할 수 있습니다.
참조
Lynnyk A, Lunova M, Jirsa M, Egorova D, Kulikov A, Kubinová Š, Lunov O, Dejneka A. 저전력 레이저 조사를 이용한 인간 간세포주 Huh7의 미토콘드리아 활성 조절. Biomed Opt Express. 2018년 2월 21일;9(3):1283–1300. doi:10.1364/BOE.9.001283. PMID: 29541521; PMCID: PMC5846531.
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제품명 |
사양 |
카탈로그 번호 |
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1000톤 |
50101ES01 |