の T7高収量RNA合成キットの説明

T7 高収率 RNA 合成キットは、転写反応システムを最適化します。このキットは、T7 RNA ポリメラーゼ、テンプレートとして T7 プロモーター配列を持つ直線化された二本鎖 DNA、プロモーター下流の DNA 配列を転写するための基質として NTP を使用して、一本鎖 RNA を効率的に合成できます。転写中に、修飾ヌクレオチドを基質として追加して、ビオチンまたは色素標識 RNA を生成することもできます。

このキットは長い転写産物と短い転写産物の両方を合成することができ、1 μg の DNA テンプレート入力で 100 ～ 200 μg の RNA を生成できます。転写によって合成された RNA は、RNA の構造と機能の研究、RNase 保護、プローブのハイブリダイゼーション、RNAi、マイクロインジェクション、in vitro 翻訳など、さまざまな下流アプリケーションに使用できます。

合成原理

図1: 試験管内RNA転写プロセス

製品の利点

高収量：転写反応により2時間で最大200μgを生産可能

汎用性が高い： 20nt～10000ntのRNAの転写に適しています

優れた性能： IVTプロセス中の転写副産物を効果的に削減

多様な用途:通常のRNA合成、標識RNA合成、修飾RNA合成に使用可能

製品特性

図2: 異なる長さの転写産物の収量

図3: 異なる長さの転写産物の品質

図4: HEK-293細胞における転写されたmRNAの発現

注: mRNA は Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615) でキャップされています。

実験方法

解凍試薬

T7 RNAポリメラーゼミックスを軽く遠心分離し、氷上に置きます。10 ×転写バッファーとリボヌクレオチド（ATP、CTP、GTP、UTP）を解凍し、チューブの底に混ぜて遠心分離し、10×転写バッファーを室温に置き、4種類のリボヌクレオチドを氷上に置きます。

B.室温でのアセンブリ転写反応

以下のシステムに従って反応システムを準備します。

コンポーネント	容量（µL）	最終濃度
RNaseフリーH ₂ O	最大20	-
10×転写バッファー	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP（各100 mM）	各2個	各10mM
テンプレートDNA	1µg	-
T7 RNAポリメラーゼミックス	2	-

注:

反応は室温で行われます。10×転写バッファーにはスペルミジンが含まれているため、スペルミジンの濃度が高いと低温で DNA テンプレートが沈殿する可能性があります。
短い転写産物（<100 nt）の場合、2 µg のテンプレートを使用でき、転写時間は 4 ～ 8 時間に延長されます。
3. 長い転写産物（>1000 nt）の場合、転写のテンプレートとして線状化プラスミドを使用することを推奨します。
4. 蒸発を防ぐために、熱い蓋を開けた状態で PCR 装置内で反応を実行します。
5. 反応生成物に白い沈殿物が生じる場合があります。この沈殿物は、反応溶液中の遊離ピロリン酸とマグネシウムイオンによって生成されたピロリン酸マグネシウムであり、その後の実験には影響しません。沈殿物を除去したい場合は、EDTA を少し加えることができます。EDTA の添加がその後の実験に影響する場合は、遠心分離によって上清を回収することもできます。
6. 試薬と容器をRNase汚染のない状態に保ってください。

C.37℃で2時間インキュベートする

成分溶液を混合し、チューブの底に軽く遠心分離し、37°C で 2 時間インキュベートします。転写産物の長さが 100 nt 未満の場合は、反応時間を 4 ～ 8 時間に延長します。

D.DNase I処理（オプション）

反応が完了したら、各チューブに 2 μL の DNase I (RNase フリー) を加え、37°C で 15 分間インキュベートしてテンプレート DNA を除去します。

よくある質問

転写産物の収量が低い

テンプレートの品質は収量と密接に関係しています。実験グループの収量は対照グループよりも大幅に低くなっています。考えられる理由は次のとおりです。

実験テンプレートには阻害成分が含まれています。
テンプレートに何か問題がある可能性があります。

提案: ①テンプレートを再精製する。 ②テンプレートの定量と完全性を決定する。 ③反応時間を延長する。 ④テンプレートの投入量を増やす。 ⑤他のプロモーターと他のRNAポリメラーゼを使用する。

短いトランスクリプトの収量が低い

短いテンプレート断片は反応を阻害する可能性があります。転写産物が 100 nt 未満の場合に収量を増やしたい場合は、反応時間を 4 ～ 8 時間に延長するか、テンプレートの量を 2 μg に増やしてください。

RNA転写の長さは予想よりも長い

電気泳動の結果、生成物のバンドが予想サイズよりも大きいことが示された場合、考えられる理由は次のとおりです。①プラスミドテンプレートが完全に直線化されていない可能性があります。②センス鎖の 3' 末端に目立つ構造があります。③RNA に完全に変性していない二次構造があります。

提案: ①テンプレートが完全に直線化されているかどうかを確認し、必要に応じて追加の直線化を実行します。 ②3' オーバーハングを避けるために適切な制限酵素を選択するか、Klenow Fragment /T4 DNA ポリメラーゼを使用して転写を完了してから続行します。 ③変性ゲルを使用して RNA 産物を検出します。

RNA転写の長さは予想よりも短い

電気泳動の結果、産物バンドが予想サイズよりも小さい場合、考えられる理由は次のとおりです。①テンプレートにT7 RNAポリメラーゼターミネーターに類似した終結配列が含まれている。②テンプレートのGC含有量が高すぎる。

提案：①反応温度を下げます（例：30℃）。温度を下げると転写長が長くなることがありますが、収量が減少する可能性があります。転写には他のRNAポリメラーゼを試してください。②テンプレートのGC含有量が高い場合は、42℃で反応を実行するか、SSBを追加して収量と転写長を増やします。

転写産物の電気泳動によるテーリング

電気泳動中のテーリングは、以下の原因によって発生する可能性があります: ① 実験操作中の RNase 汚染; ② DNA テンプレートが RNase に汚染されている。

提案: ①RNaseフリーのピペットチップとEPチューブを使用し、使い捨てのラテックス手袋とマスクを着用し、すべての試薬はRNaseフリーのH ₂ Oで調製します。 ②テンプレートDNAを再精製します。

注文情報

製品名	カタログ番号	仕様
T7 高収量RNA合成キット	10623ES	50/100/500 トン
T7 RNAポリメラーゼGMPグレード（250 U/μL）	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
ピロホスファターゼ、無機 GMP グレード (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
マウスRNase阻害剤GMPグレード（40 U/μL）	10621ES	10区/20区/100区/1MU
mRNA ワクシニアキャッピング酵素 GMP グレード	10614ES	2KU/10KU/100KU
mRNA キャップ 2'-O-メチルトランスフェラーゼ GMP グレード	10612ES	10区/50区/250区
デオキシリボヌクレアーゼI（DNase I）GMPグレード	10611ES	500/2000/10000 ユニット
Hieff NGS® mRNA 分離マスターキット	12603ES	24/96 タイム

T7高収量RNA合成キットは、異なる長さの転写産物の効率的な合成を容易にします。