従来のハイフィデリティ酵素を用いたPCRでは、いくつかの厄介な問題に直面することは避けられません。例えば、フィデリティが十分でない場合、増幅断片をシーケンシングした後でも標的塩基に変異や欠失が生じる可能性があります。また、増幅時間も比較的長く、5kbの断片を増幅するのに2時間近くかかることもあります。XiaoYiは、これらの問題を解決するための高速ハイフィデリティPCRを発表しました。――Hieff Canace™ AdvanceFast PCR Master Mix（超高速ハイフィデリティPCRプレミックス）。
2× Hieff Canace™ AdvanceFast PCRマスターミックス（色素入り）には、電気泳動指示薬があらかじめ添加されているため、PCR産物をそのまま電気泳動に使用できます。増幅産物は平滑末端です。このハイフィデリティ酵素ミックスは、迅速、シンプル、高感度、高特異性、そして安定性といった利点を備えています。反応系にはプライマーとテンプレートのみを添加するだけで済みます。さらに、本製品には特定の保護剤が含まれており、繰り返しの凍結融解後でもハイフィデリティPCRプレミックスの安定した活性を維持します。
製品の特徴
- 高忠実度: ミスマッチ率が低く、GC 変異を起こしやすい配列では塩基ミスマッチ比が 231/300,000 です。
- 高速増幅速度: 伸長速度は 1kb あたり 5 秒と高速です。
- 幅広い適用性: GC含有量20〜80%の遺伝子をカバーでき、マウス溶解物および20%の血液にも耐えます。
- 優れた安定性: 製品の性能に影響を与えることなく、37°C で 7 日間保管できます。
- 高速かつ便利: 増幅のためにプライマーとテンプレートを追加するだけで、直接電気泳動するためのローディングダイが付属しています。
製品性能デモンストレーション
高い忠実度、低いミスマッチ率
異なる種のゲノムを鋳型として、塩基の変異／欠失が生じやすいGCリッチな断片を6つ選択し、増幅を行った。それぞれのPCR産物をベクターにクローニングし、各配列から100個の単一クローンを選別してシーケンシングを行い、塩基ミスマッチ／変異の発生状況を確認した。その結果、迅速ハイフィデリティPCRマスターミックス（10164ES）は、国内外のブランド試薬と比較して、塩基ミスマッチ／変異の検出率が優れていることが示された。
延長時間は最大5秒/kbに達する可能性がある
高速高忠実度酵素プレミックス（10164ES）と製品Tを用いて、100 ngのヒトゲノムDNAテンプレートから、伸長速度5秒/kbで、異なる長さの断片（0.4～10 kb）を増幅しました。伸長時間は5秒/kbとしました。その結果、高速高忠実度酵素プレミックス（10164ES）は、10 kb以内の断片を伸長速度5秒/kbで増幅できることが示されました。
GC含有量の異なる遺伝子断片を増幅できる
高速高忠実度酵素プレミックス（10164ES）を用いて、ヒトゲノムDNAテンプレートからGC含量23～76%の遺伝子断片を増幅しました。伸長時間は5秒/kbに設定しました。その結果、本製品は優れた増幅特異性を有し、GC含量の異なる断片を増幅できることが示されました。
GC含有量の異なる遺伝子断片を増幅可能
高速ハイフィデリティ酵素プレミックス（10164ES）を用いて、様々なサンプルから様々な長さの断片を増幅しました。伸長時間は1キロベースあたり5～10秒に設定しました。結果は、本製品が優れた増幅特異性を示し、様々なテンプレートからの様々な断片の増幅に適合していることを示しています。
注: 1. マウスゲノム DNA 1 kb、2. マウスゲノム DNA 2 kb、3. マウスゲノム DNA 6 kb、4. トウモロコシゲノム DNA 1 kb、5. イネゲノム DNA 2 kb-A、6. イネゲノム DNA 2 kb-B、7. ヒト 293 細胞 cDNA 1 kb、8. ヒト 293 細胞 cDNA 2 kb、9. ヒト 293 細胞 cDNA 3 kb、10. ヒト 293 細胞 cDNA 12 kb、11. 大腸菌ブロス 8 kb、12. 大腸菌ブロス 16 kb、13. イネゲノム DNA 10 kb-A、14. イネゲノム DNA 10 kb-B、15. イネゲノム DNA 10 kb-C。 16. イネゲノム DNA 20 kb-A; 17. イネゲノム DNA 20 kb-B; 18. ヒト血液直接増幅 3 kb。
異なる種間でのテンプレート増幅の高検出率
迅速で高忠実度の酵素プレミックス（10164ES）を用いて、アラビドプシス、菜種、ジャガイモにおける0.5～10kbのGC含量を持つ様々な断片を、伸長時間5秒/kbで増幅した。その結果、迅速で高忠実度の酵素プレミックス（10164ES）が確実に増幅できることが示された。
高速高忠実度酵素プレミックス（10164ES）を用いて、シロイヌナズナ、菜種、ショウジョウバエ、線虫（Caenorhabditis elegans）、ゼブラフィッシュからランダムに抽出した配列（断片サイズは0.5～10 kb、GC含量20～80%）を増幅した。伸長時間は5秒/kbに設定した。結果、高速高忠実度酵素プレミックス（10164ES）は高い検出率を示すことが示された。
優れた安定性
加熱加速処理済みの高速高忠実度酵素プレミックス（10164ES）を37℃で3日間および7日間保存し、100 ngのヒトゲノムDNAから3 kbおよび5 kbのDNA断片を増幅しました。伸長時間は5秒/kbに設定しました。結果は、本製品が良好な安定性を有することを示しています。
顧客からのフィードバック
動物gDNA-120bp-50%GC
顧客評価：PCRプロセスは高速で、バンドも適切で、アガロースゲル電気泳動に直接ロードできます。Nブランドのバンドは上方に偏っていますが、これは製品自体のバッファーの影響によるものと考えられます。ローディングバッファーを添加していないため、現在の実験プロトコルにおいて、本製品は高忠実度酵素の代替として使用できます。
植物cDNA-729bp-45.13%GC
お客様からの評価：Tブランドと比較して、クローニングバンドはより鮮明で均一で、PCRプロセス全体がより高速です。ゲル電気泳動時に追加の色素を加える必要がないため、非常に便利で時間の節約になります。
微生物gDNA-1158、1953bp-58.8%、52.9%GC
お客様の評価：Vブランドと比べても効果は同等ですが、個人的にはさらに優れていると感じています。
植物cDNA-2000bp-40%GC
お客様の評価：効果は非常に良く、ストリップも鮮明です。
高忠実度PCR選択ガイド
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製品の位置付け |
製品名 |
猫＃ |
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5秒/kb、忠実性と速度を確保（染料使用） |
10164ES |
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83×Taq、高検出率（色素入り） |
10154ES |
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83×Taq単一酵素 + バッファー別 |
10153ES |
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1～7フラグメントワンステップクローニング |
10923ES |
拡張読書
Hieff Clone Universal II ワンステップクローニングキット —— 1～7フラグメントのワンステップクローニング