qPCR プライマーはイントロンにまたがる必要がありますか?

qPCRプライマーはイントロンをまたぐ必要があるのでしょうか？まずは結論から述べます。
RNA 抽出中（DNase I の使用など）または逆転写中にゲノム DNA（gDNA）が除去され、RNA のみが残っている場合、通常、イントロンにまたがらないプライマーを設計しても影響はほとんどありません。
しかし、RNA抽出時にgDNAが除去されない場合、得られるRNAサンプルにはゲノムDNAが残留します。このような場合、プライマーがイントロンをまたいでいないと、cDNAに加えてDNA断片も増幅され、 mRNAの発現レベルが誤って上昇する可能性があります。

イントロンをまたぐと DNA 増幅を回避できるのはなぜですか?

これを理解するには、まずDNAとmRNAの構造的違いを認識する必要があります。下の図に示すように、残留DNAが存在する場合、イントロンをまたぐプライマーは、ゲノムDNA中の大きなイントロン配列によって区切られた領域に結合します。
qPCR酵素（一般的に500bp未満の断片を増幅する）の特性上、イントロンを含む長いゲノムテンプレートは増幅されにくい傾向があります。一方、イントロンを含まないmRNAは、標的断片を効率的に増幅します。

 図1: DNAがmRNAに転写される模式図

 プライマー設計時にゲノムDNAの増幅を避けるため、まず遺伝子構造を解析し、十分に長いイントロンを選択します。次に、このイントロンを挟むエクソンにフォワードプライマーとリバースプライマーを設計します。

リアルタイム PCR では、目的のアンプリコンは通常短く（100～300 bp）、PCR 条件は短い断片に合わせて最適化されます。 500 bpを超える断片は増幅が困難です。 プライマー間のイントロンが長い場合、ゲノム DNA 増幅は非効率的になるか、完全に失敗します。

 図2: イントロンをまたぐプライマーはゲノムDNAの増幅を防ぐ

イントロンが短い場合はどうなるでしょうか?

イントロンが短い場合は、エクソン-エクソン接合部にプライマーを1本設計し、イントロンスプライスサイトをまたぐように配置することができます。これにより、ゲノムDNAの増幅も防止されます。
ただし、この方法は以下の場合には適していません。

エクソンが1つだけの遺伝子

イントロンを持たない生物

ゲノムが注釈されていない種

 図3: 短いイントロンのためのプライマー設計戦略

 プライマー設計ツール

シーケンス入力による設計: https://www.primer3plus.com/

遺伝子名を使用した設計: https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

 プライマー設計における重要な考慮事項

最適なプライマーの長さ： 18～30ヌクレオチド

理想的な融解温度（Tm）： 65℃～75℃ 、フォワードプライマーとリバースプライマー間のTm差は5℃以下

Tmが低すぎる場合は、 GC含有量を増やすか、プライマーの長さを少し長くしてみてください。

ターゲットGC含有量： 40～60％；プライマーは結合を強化するために3'末端がCまたはGで終わるのが理想的

酵素効率を向上させるために、制限酵素部位の前の5'末端に3～4ヌクレオチドを追加します。

二次構造のある領域を避け、ATリッチ領域とGCリッチ領域のバランスの取れた分布を目指す

避ける：

• 4つ以上の同一のヌクレオチドまたはジヌクレオチドの繰り返し（例：ACCCCまたはATATATAT）
• プライマー内の自己相補性（3塩基以上）
• フォワードプライマーとリバースプライマー間の相補性
  これらの問題はプライマーダイマーや自己アニーリングを引き起こし、特異性の低下を招く可能性がある。

クローニングの場合、最低限の精製基準としてカラム精製が推奨される。

突然変異誘発のために、ミスマッチ塩基をプライマーの中央に配置する

Invitrogen TOPOクローニングで使用されるPCRプライマーでは、プライマーをリン酸化しないでください。

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