HEK293宿主細胞 DNA 残留物検出キット(3 G )
資格概要（カタログ番号：4 1331 ES60）
- 背景
このレポートにまとめられたデータは、
- 実験材料と方法
2.1 HEK293 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G)、ベンダー:
2.2 MolPure® 磁気残留 DNA サンプル調製キット、ベンダー:
2.3 オリジナルデータ: 電子版は、親ファイル「HEK293 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G)」のサブファイル「実験レポート」に記録されています。
2.4 方法: 実験に使用された材料と操作方法は、基本的に
- 予選内容と結果
3.1 検出範囲
キットの直線範囲は 30 fg/μL ～ 300 pg/μL で R 2 ≥ 0.998 であり、増幅効率は各濃度アッセイで 90% ～ 110% の範囲で CV < 15% でした。
図1 HEK293 DNA (3G) qPCR標準曲線
3.2 精度
3. 2 . 1 回復
3.2.1.1 ブランクサンプル添加回収実験
高濃度および低濃度（それぞれ 300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL）の HEK293 DNA 標準サンプルを調製し、残留 DNA サンプル前処理キット用の磁気ビーズ法を使用して抽出後に分析し（各サンプルに対して 2 回の抽出反復を実行し、各抽出に対して 3 回の分析反復を実行）、サンプルの回収率と CV を分析しました。
さまざまな濃度の DNA サンプルに対して、回収率は 70% ～ 130% の範囲で、CV はすべて 20% 未満でした。
|
サンプルタイプ |
理論濃度 |
抽出1平均 |
抽出2の平均 |
平均濃度 |
履歴書 |
回復 |
|
空白サンプル |
/ |
/ |
/ |
/ |
/ |
/ |
|
回復サンプル1 |
300 pg/μL |
306.81 pg/μL |
279.57 pg/μL |
293.82 pg/μL |
6.56% |
97.94% |
|
回復サンプル2 |
3pg/μL |
3.11pg/μL |
2.99pg/μL |
3.09 pg/μL |
2.75% |
103.00% |
|
回復サンプル3 |
30 fg/μL |
31.02 fg/μL |
30.63 fg/μL |
30.83 fg/μL |
0.89% |
102.77% |
表1 ブランクサンプルのスパイク回収率
3.2.1.2 模擬サンプルスパイク回収実験
同じ濃度（HEK293 DNA 3 pg/μL）のサンプルを 5 つの異なるバックグラウンド溶液（高タンパク質、高核酸、高 pH および低 pH、高塩分）で抽出し（各サンプルに対して 2 回の抽出反復、各抽出に対して 3 回のアッセイ反復を実行）、サンプルの回収率と CV を分析しました。
さまざまなバックグラウンド ソリューションの DNA サンプルの回収率は 70% ～ 130% の範囲で、すべての CV は 20% 未満でした。
|
サンプルタイプ |
理論濃度 |
抽出1平均 |
抽出2の平均 |
平均濃度 |
履歴書 |
回復 |
|
基本サンプル |
/ |
/ |
/ |
/ |
/ |
/ |
|
高タンパク |
3pg/μL |
2.65 |
2.80 |
2.73 |
3.80% |
90.87% |
|
高核酸 |
2.82 |
2.97 |
2.90 |
3.71% |
96.58% |
|
|
塩分が多い |
2.88 |
2.70 |
2.79 |
4.47% |
92.89% |
|
|
高pH |
2.81 |
2.93 |
2.87 |
2.98% |
95.71% |
|
|
低pH |
2.76 |
2.79 |
2.77 |
0.99% |
92.48% |
表2 基本的なサンプルスパイク回収
3.3 精度
3. 3.1再現性
HEK293 DNA 標準物質に対して、濃度 30 fg/μL、CV <15% でアッセイを 10 回繰り返します。
|
繰り返し |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
平均 |
CV% |
|
検出値（fg/μL） |
29.51 |
30.02 |
30.13 |
30.16 |
27.99 |
31.01 |
31.05 |
30.95 |
31.02 |
29.86 |
30.17 |
3.15% |
表3 再現性の結果
3. 3 . 2 中精度
3 人の実験者が独立して HEK293 DNA 標準サンプルを高濃度と低濃度 (300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL) でテストし、各濃度で 3 回反復してテストしたところ、得られた 9 つのデータすべての CV は 15% 未満でした。
|
経験 |
実際の濃度 理論濃度 |
HEK293 DNA (3G) |
||
|
300 pg/uL |
3pg/μL |
30 fg/uL |
||
|
経験1 |
決意1 |
319.58 |
3.026 |
32.02 |
|
決意2 |
309.76 |
3.051 |
37.01 |
|
|
決意3 |
309.24 |
3.067 |
36.03 |
|
|
実験2 |
決意4 |
308.34 |
2.909 |
29.91 |
|
決意5 |
308.54 |
2.9 |
29.67 |
|
|
決意6 |
305.83 |
2.921 |
28.85 |
|
|
経験3 |
決意7 |
299.11 |
3.035 |
29.36 |
|
決意8 |
300.07 |
2.833 |
31.14 |
|
|
決意9 |
302.03 |
3.033 |
33.07 |
|
|
/ |
平均 |
306.95 |
2.975 |
31.90 |
|
/ |
CV% |
2.03% |
2.83% |
9.26% |
表4 中間精度の結果
3.4 特異性
バイオ医薬品の製造に一般的に使用される細胞ゲノムDNAの干渉について、HEK293 DNA検出試薬との干渉を評価したところ、干渉群は対照群と重複し、干渉は見られませんでした（下図は、CHO、E.coli、Pichia PastorisゲノムDNAとHEK293 DNA検出試薬との干渉データを順に示したものです）。
図2 干渉実験結果
3.5 定量限界
HEK293 DNA は、30 fg/μL、20 fg/μL、10 fg/μL、5 fg/μL で検出され、各濃度で 10 回反復されました。結果は、10 fg/μL 以上の濃度で CV が 20% 未満であることを示しました。つまり、HEK293 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G) の定量限界は 10 fg/μL でした。
|
繰り返し テスト項目 |
HEK293 DNA (3G) (fg/μL) |
|
|
量 |
再計算率% |
|
|
1 |
11.04 |
110.40% |
|
2 |
9.97 |
99.70% |
|
3 |
11.12 |
111.20% |
|
4 |
11.07 |
110.70% |
|
5 |
11.21 |
112.10% |
|
6 |
9.93 |
99.30% |
|
7 |
10.25 |
102.50% |
|
8 |
10.16 |
101.60% |
|
9 |
10.08 |
100.80% |
|
10 |
10.11 |
101.10% |
|
平均 |
10.49 |
/ |
|
CV% |
5.14% |
/ |
図3 10fg/μL HEK293 DNA（3G）qPCRテスト結果
3.6 堅牢性
このキットはテスト済みであり、以下の機器に適していますが、これらに限定されません。
|
ベンダー |
機器モデル |
増幅効率 |
2 位 |
定量限界（fg/μL） |
CV% |
|
サーモ |
7500 の |
102.84% |
1 |
10 |
7% |
|
サーモ |
ABI QuantStudio5 |
104.70% |
0.999 |
10 |
9% |
|
上海紅石 |
スラン |
101.46% |
0.999 |
10 |
8% |
表5 機器適合性試験結果
3.7 安定性
3. 7 .1凍結融解安定性
HEK293 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G) は、凍結と解凍を 10 回繰り返してテストされましたが、キットの性能には影響がありませんでした。
|
テスト指標 凍結融解時間 |
パラメータ |
T0時間 |
凍結融解10回 |
|
標準曲線パラメータ |
増幅効率 |
99.34% |
100.78% |
|
2 位 |
1 |
1 |
|
|
定量限界（30 fg/μL） |
履歴書 |
11% |
7% |
表6 凍結融解安定性結果分析
3. 7 . 2 加速された安定性
HEK293 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G) は、それぞれ 2 ～ 8°C で 30 日間、37°C で 14 日間保管されました。キットの性能には影響はありませんでした。
|
テスト指標 加速温度と時間 |
パラメータ |
T0時間 |
37℃ 7日間 |
37℃ 14日 |
|
標準曲線パラメータ |
増幅効率 |
103.83% |
101.58% |
100.47% |
|
2 位 |
0.999 |
1 |
1 |
|
|
定量限界（30 fg/μL） |
CV% |
8% |
5% |
5% |
表7 加速安定性結果分析
3.8 空白の制限
テンプレートなしコントロール (NTC) は、CT 値が 32 を超える 96 回の繰り返し (ROX キャリブレーションしきい値ラインは 0.06 に設定) を伴うテンプレート希釈でした。
図4 NTC実験結果
- 4 .参照
4.1 中国薬局方委員会（ChPC）。中華人民共和国薬局方（第3巻）[S]。北京：中国医学科学技術出版社、p.542-543、2020年。
4.2 NMPA、2007: 生物学的製品の品質管理のための分析方法検証の技術レビューに関する一般原則。
4.3 ICH(2022)《分析法バリデーションQ2》草案版。
注文情報
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説明 |
部品番号 |
|
41332ES |
|
|
41331ES |
|
|
41307ES |
|
|
41308ES |
|
|
18461ES |
|
| MycAway™ マイコプラズマ qPCR 検出キット (2G) | 40619ES |