CHO 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G) 検証レポート

CHO宿主細胞 DNA 残留物検出キット(3 G )

資格概要（カタログ番号: 41332 ES60）

1. 背景

このレポートにまとめられたデータは、CHO 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G) 製品について Yeasen Biotechnology が実施したものです。要約データはユーザーの参考用であり、ユーザーは独自のサンプルを使用して宿主細胞残留物 DNA 法を検証し、その方法がユーザーの要件を満たしていることを確認する必要があります。このキットを使用するすべての研究室は、直線性、範囲、正確性、精度、定量限界、特異性、堅牢性などのパラメータを検証することをお勧めします。

Yeasen Biotechnology は、このキットの詳細な適格性レポートを提供できます。ユーザーがこのレポートを使用する場合は、適合性 (精度、正確性、特異性を含む) のみを検証する必要があります。

2. 実験材料と方法

2.1 CHO 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G)、ベンダー: Yeasen、カタログ番号: 41332ES60。

2.2 MolPure 磁気残留 DNA サンプル調製キット、ベンダー: Yeasen、カタログ番号: 18461ES60。

2.3 オリジナルデータ: 電子版は、親ファイル「CHO 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G)」のサブファイル「実験レポート」に記録されています。

2.4 方法: 実験に使用された材料と操作方法は、基本的に Yeasen Biotechnology によって作成または設定されたもので、長期間にわたって評価および検証されており、キットの開発と製造は ISO 13485 システムに従っています。

3. 予選内容と結果

3.1 検出範囲

キットの直線範囲は 3 fg/μL ～ 300 pg/μL、R ² =1 であり、増幅効率は各濃度アッセイで 99.09%、CV < 15% でした。

図1 CHO DNA (3G) qPCR標準曲線

3.2 精度

3. 2 . 1 回復​

3.2.1.1 ブランクサンプル添加回収実験

高濃度および低濃度（それぞれ 30 pg/μL、300 fg/μL、3 fg/μL）の CHO DNA 標準サンプルを調製し、残留 DNA サンプル前処理キッ​​ト用の磁気ビーズ法を使用して抽出後に分析し（サンプルごとに 3 回の抽出反復を実行し、抽出ごとに 3 回の分析反復を実行）、サンプルの回収率と CV を分析しました。

さまざまな濃度の DNA サンプルに対して、回収率は 70% ～ 130% の範囲で、CV はすべて 20% 未満でした。

サンプルタイプ	理論濃度	抽出1平均	抽出2の平均	抽出3平均	平均濃度	履歴書	回復
空白サンプル	/	/	/		/	/	/
回復サンプル1	30pg/μL	27.07	27.51	28.27	27.62	2.20%	92.06%
回復サンプル2	300 fg/μL	285.53	301.25	295.71	294.16	2.71%	98.05%
回復サンプル3	3 fg/μL	3.50	3.54	3.31	3.45	3.56%	115.00%

表1 ブランクサンプルのスパイク回収率

3.2.1.2 模擬サンプルスパイク回収実験

同じ濃度（300 fg/μLのCHO DNA）のサンプルを、5つの異なるバックグラウンド溶液（高タンパク質、高核酸、高pHと低pH、高塩分）で抽出し（サンプルごとに3回の抽出反復、抽出ごとに3回のアッセイ反復を実施）、サンプルの回収率とCVを分析しました。

さまざまなバックグラウンド ソリューションの DNA サンプルの回収率は 70% ～ 130% の範囲で、すべての CV は 20% 未満でした。

サンプルタイプ	理論濃度	抽出1平均	抽出2の平均	抽出3平均	平均濃度	履歴書	回復
基本サンプル	/	/	/		/	/	/
高タンパク	300 fg/μL	302.29	332.86	342.76	325.97	6.47%	108.66%
高核酸		284.47	290.66	308.76	294.63	4.28%	98.21%
塩分が多い		272.96	286.25	312.91	290.71	7.00%	96.90%
高pH		296.04	320.58	324.56	313.72	4.92%	104.57%
低pH		314.77	327.89	340.26	327.64	3.89%	109.21%

表2 基本的なサンプルスパイク回収

3.3 精度

3. 3.1再現性

CHO DNA 標準物質に対して、濃度 3 fg/μL、CV <15% でアッセイを 10 回繰り返します。

繰り返し	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均	CV%
検出値（fg/μL）	3.13	3.26	2.89	3.16	2.95	2.87	2.88	2.75	2.87	3.15	2.99	5.65%

表3 再現性の結果

3. 3 . 2 中精度

3 人の実験者が独立して CHO DNA 標準サンプルを高濃度と低濃度 (300 pg/μL、3 pg/μL、3 fg/μL) でテストし、各濃度で 3 回反復してテストしたところ、得られた 9 つのデータすべての CV は 15% 未満でした。

経験	実際の濃度 理論濃度	CHO DNA (3G)
		300 pg/uL	3pg/μL	3 fg/uL
経験1	決意1	302.63	2.97	3.40
	決意2	294.54	3.01	3.14
	決意3	287.67	2.99	3.01
実験2	決意4	292.27	2.92	3.47
	決意5	299.61	2.90	2.82
	決意6	305.73	2.93	2.90
経験3	決意7	301.06	3.17	3.15
	決意8	299.17	3.00	3.21
	決意9	290.66	2.90	3.05
/	平均	297.04	2.98	3.13
/	CV%	2.03	2.80	6.85

表4 中間精度の結果

3.4 特異性

バイオ医薬品の製造に一般的に使用される細胞ゲノムDNAのCHO DNA検出試薬への干渉を評価したところ、干渉群は対照群と重複し、干渉は見られませんでした（下図は、マウス、MDCK、HEK293、大腸菌ゲノムDNAとCHO DNA検出試薬の干渉データを順に示しています）。

図2 干渉実験結果

3.5 定量限界

CHO DNA は、3 fg/μL、1 fg/μL、0.5 fg/μL、0.3fg/uL、0.1 fg/μL で検出され、各濃度で 10 回反復されました。結果は、0.3 fg/μL 以上の濃度で CV が 20% 未満であることを示しました。つまり、CHO 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G) の定量限界は 0.3 fg/μL でした。

繰り返し テスト項目	CHO DNA (3G) (fg/μL)
	量	再計算率%
1	0.28	93.33%
2	0.26	86.67%
3	0.32	106.67%
4	0.30	100.00%
5	0.33	110.00%
6	0.23	76.67%
7	0.29	96.67%
8	0.37	123.33%
9	0.31	103.33%
10	0.28	93.33%
平均	0.30	/
CV%	13.09%	/

図3. CHO DNA (3G) qPCR検査結果

3.6 検出限界

CHO DNAは、0.3 fg/μL、0.1 fg/μL、0.05 fg/μL、0.01 fg/μLで、各濃度で20回の反復試験で検出されました。結果は、0.05 fg/μL以上の濃度で、20回の反復試験ウェルで検出率が≥19（つまり、検出率≥95%）であることを示しました。つまり、CHO宿主細胞DNA残留物検出キット（3G）の検出限界は0.05 fg/μLでした。

図4. CHO DNA (3G) qPCR検査結果

3.7 堅牢性

このキットはテスト済みであり、以下の機器に適していますが、これらに限定されません。

ベンダー	機器モデル	増幅効率	2 位	定量化の限界	履歴書	検出限界	検出率
サーモ	7500 の	99.69%	1	0.3 fg/μL	12.40%	0.05 fg/μL	95.65%
サーモ	ABI QuantStudio5	99.26%	1	0.3 fg/μL	15.30%	0.05 fg/μL	100.00%
ロシュ	ライトサイクラー480	2.05%	0.978	0.3 fg/μL	/	0.05 fg/μL	/
上海紅石	スラン	101.14%	0.999	0.3 fg/μL	14.41%	0.05 fg/μL	95.65%

表5 機器適合性試験結果

3.8 安定性

3. 8.1凍結融解安定性

CHO 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G) は、凍結と解凍を 10 回繰り返してテストされましたが、キットの性能には影響がありませんでした。

テスト指標 凍結融解時間	パラメータ	T0時間	凍結融解10回
標準曲線パラメータ	増幅効率	95.70%	98.62%
	2 位	1	1
定量限界（0.3 fg/μL）	履歴書	15.31%	17.16%
検出限界（0.05 fg/μL）	検出率	95.65%	100%

表6 凍結融解安定性結果分析

3. 7 . 2 加速された安定性

CHO 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (3G) は、それぞれ 2 ～ 8°C で 30 日間、37°C​​ で 14 日間保存されました。キットの性能には影響はありませんでした。

テスト指標 加速温度と時間	パラメータ	実験1		実験2
		T0時間	2~8℃ 30日	T0時間	37℃ 14日
標準曲線パラメータ	増幅効率	100.53%	102.61%	101.76%	101.84%
	2 位	1	1	1	1
定量限界（0.3 fg/μL）	履歴書	17.16%	12.63%	16.27%	12.49
検出限界（0.05 fg/μL）	検出率	95.65%	100%	95.57%	100%

表7 加速安定性結果分析

3.9 空白の制限

3. 9 .1テンプレート制御なし（NTC）

テンプレートなしコントロール (NTC) は、qPCR 定量アッセイを行うために 96 回繰り返した DNA 希釈であり、テストされた 96 回の反復ウェルを超えるすべての CT 値は 40 を超えました。

図5 NTC実験結果

3. 9 . 2 ネガティブ抽出コントロールサンプル (NCS)

ネガティブ抽出コントロールサンプル (NCS) は DNA 希釈液であり、最初にサンプル前処理によって抽出され、次に qPCR が実行され、テストされた 48 個の複製ウェルを超えるすべての CT 値は 40 を超えました。

図6 NCS実験結果

4. 4 .参照

4.1 中国薬局方委員会（ChPC）。中華人民共和国薬局方（第3巻）[S]。北京：中国医学科学技術出版社、p.542-543、2020年。

4.2 NMPA、2007: 生物学的製品の品質管理のための分析方法検証の技術レビューに関する一般原則。

4.3 ICH(2022)《分析法バリデーションQ2》草案版。

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