リゾチーム
リゾチームはムラミダーゼまたは N-アセチルムラミドグリカノヒドロラーゼとも呼ばれ、細菌内のムコ多糖類を加水分解できるアルカリ酵素です。
リゾチームのメカニズム
リゾチームは主に細胞壁のN-アセチルムラミン酸とN-アセチルグルコサミン間のβ-1,4グリコシド結合を破壊し、細胞壁の不溶性ムコ多糖類を可溶性糖ペプチドに分解し、細胞壁を破壊して内容物を流出させ、細菌を溶解します。
リゾチームの供給源
この酵素は、人体の様々な組織、鳥類や家禽類の卵白、哺乳類の涙液、唾液、血漿、乳汁などの体液、そして微生物にも広く存在し、中でも卵白に最も多く含まれています。様々な文献によると、植物リゾチーム、動物リゾチーム、微生物リゾチーム、卵白リゾチームの4つのカテゴリーに分類されます。
図1: リゾチームのタンパク質構造
リゾチームの発見過程
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人 |
時間 |
貢献 |
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チャールズ・ニコル |
1907 |
細菌溶解現象を初めて報告し、細胞壁分解の仮説を提唱した。 |
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ラシュチェンコ |
1909 |
卵白の抗菌作用は酵素によるものであることが発見された |
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アレクサンダー・フレミング |
1922 |
リゾチームを発見し命名、その広範な存在と抗菌作用を確認 |
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ロバート・ロビンソン |
1937 |
リゾチームの初期精製を達成 |
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デビッド・フィリップス |
1965 |
リゾチームの構造を解析し、触媒機構を明らかにし、酵素学とタンパク質化学の発展を促進した。 |
リゾチームの製造プロセス
1.卵白からリゾチームを抽出するための典型的なプロセスフロー
（新鮮な卵白1kgを原料とし、トンレベルまでスケールアップ可能）
1 ）前処理
- 卵を割る→濾過する→粘度を下げるために脱イオン水で1～2倍に希釈する。
- pHを9.5（1mol/L NaOH使用）に調整して、卵白タンパク質を完全に膨張させます。
2 ）加熱塩沈殿
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撹拌しながら5% NaCl（w/v）を加え、70～75℃まで加熱を続け、10分間維持します。
（リゾチームは耐熱性があり、この条件下では変性しません）
（熱変性により、オボアルブミンなどの不純物が凝集・沈殿する） - すぐに氷浴中で25℃まで冷却し、4℃で2時間放置し、沈殿した沈殿物を8000rpmで15分間遠心分離して上清を得る。
3)等電点結晶化
- 上清液を1mol/L HClでpH 10.5に調整→10% NaClで飽和→4℃で48～72時間放置。
- リゾチームの結晶が沈殿するので、遠心分離で結晶を集め、0.1 mol/L リン酸緩衝液 (pH 6.5) に溶解します。
4 ）再結晶と脱色
- 溶液の pH を再度 9.5 に調整し、手順 2 ～ 3 を繰り返して色素やその他のタンパク質を除去します。
- 二次結晶化後、純度は 95% (SDS-PAGE) に達し、収量は卵白 1kg あたり 0.35～0.45 g になります。
5)淡水化のための限外濾過/透析
10 kDa の限外濾過膜または透析バッグで 24 時間脱塩し、凍結乾燥させて白色粉末を得ます。
6 ）品質管理
- 比活性：≥9000 U/mg（ミクロコッカス・リソデイクティクス法）
- 塩化物: <3.5%
リゾチームの応用
1.細菌DNAの抽出
1 ）細菌培養液0.5～2mL（最大2× 10個細胞以下）を採取し、10,000rpmで2分間遠心分離し、上清を捨てる。
[注意] ：細菌細胞の量は過剰にしてはいけません。過剰にすると収量が著しく減少します。初期処理量は細菌の密度、種などに依存します。
2 ）まずリゾチーム緩衝液（20 mMトリス、pH 8.0、2 mM Na2-EDTA、1.2%トリトンX-100）を調製し、次にリゾチーム乾燥粉末をリゾチーム緩衝液に加えて最終濃度を20 mg/mLにします。
3 ）細菌、特にグラム陽性細菌の場合は、20 mg/mLリゾチーム180μLを加え、振盪して再懸濁し、37℃のウォーターバスまたはメタルバスに30分以上置きます。
4 ）プロテアーゼK（20mg/mL）20μLを加え、よく振盪しながら混合する。
5 ）残留RNAがその後の実験に影響を与える場合は、RNase A（100 mg/mL）溶液5μLを加え、よく振盪して混合し、室温で5～10分間置いてください。
6 ）結合溶液BDを200μL加え、すぐに振盪してよく混ぜ、70℃のウォーターバスまたはメタルバスに10分間置きます。
7 ） DNA吸着カラムのカラム平衡化を行う。
8 ）上記の冷却したサンプル前処理混合物にイソプロパノール100μLを加え、すぐに振動させてよく混ぜ、軽く遠心してチューブのキャップ内に液体を集める。
9 ）上記の混合物をDNA吸着カラムに加え、12,000rpmで1分間遠心分離し、廃液を捨てる。
1 0 ）脱タンパク液500μLを加え、12,000rpmで30秒間遠心し、廃液を捨てる。
11 ） 2回すすぎます。
12 ） DNA吸着カラムの中央に溶出液30～100μLを加え、遠心分離してDNA溶液を回収する。
2. 細菌RNAの抽出
1 ）まずリゾチーム緩衝液（20 mMトリス、pH 8.0、2 mM Na2-EDTA、1.2%トリトンX-100）を調製し、次にリゾチーム乾燥粉末をリゾチーム緩衝液に加え、最終濃度が1 mg/mLになるようにします。
2 ）グラム陰性細菌の場合：1 mg/mLリゾチーム希釈標準液100 μLを加え、10秒間ボルテックスし、室温で2分間インキュベートする。この振動とインキュベーションを3回繰り返す。
3 ）グラム陽性細菌の場合：1 mg/mLリゾチーム希釈標準液100 μLを加え、10秒間ボルテックスし、室温で2分間インキュベートする。この振動とインキュベーションを6回繰り返す。
[注意] ：細菌数が5×108個以上の場合、添加するリゾチーム希釈液の量は200μLです。
4 ）軽く遠心して細胞を集め、上清を捨てる。
5）細胞を再懸濁・分散させるためにボルテックスで撹拌します。500μLの溶解バッファーを加え、ピペッティングを繰り返してよく混合し、不溶性物質がなくなるまで激しくボルテックスで撹拌します。
6 ）上記の溶解液をDNA除去カラムに加え、12,000rpmで1分間遠心し、ろ液を保持する。
7 ）無水エタノールの0.5倍量を加え、すぐにピペットでよく混ぜる。
8 ）上記の混合物をRNA吸着カラムに加え、12,000rpmで1分間遠心し、廃液を捨てる。
9 ）脱タンパク液500μLを加え、12,000rpmで30秒間遠心し、廃液を捨てる。
10 ） 2回すすぎます。
1 1 ） RNA吸着カラムの中央に酵素を含まない水30～50μLを加え、遠心分離してRNA溶液を回収する。
注文情報
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製品名 |
製品番号 |
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リゾチーム |
10402ES |
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10412ES |
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10406ES |
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MolPure™ 細菌DNAキット |
18806ES |
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19301ES |