La quantificazione degli acidi nucleici, come uno degli esperimenti più fondamentali in biologia molecolare, influenza direttamente l'esito degli esperimenti a valle. L'accuratezza della quantificazione degli acidi nucleici è cruciale. Attualmente, ci sono due metodi principali di quantificazione della libreria NGS, il metodo di assorbimento ultravioletto e il metodo del colorante fluorescente.

Il metodo di assorbimento ultravioletto utilizza uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza a 260 nm per DNA e RNA da quantificare. Stima inoltre la purezza degli acidi nucleici calcolando il rapporto OD260/OD280. Tuttavia, i valori rilevati sono altamente suscettibili all'interferenza di altri contaminanti come nucleotidi liberi, sali e composti organici.

La quantificazione fluorometrica Qubit utilizza coloranti fluorescenti che si legano specificamente al DNA a doppio filamento, al DNA a singolo filamento, all'RNA o alle proteine. Dopo l'eccitazione da parte di una sorgente luminosa a lunghezza d'onda specifica, i coloranti emettono fluorescenza, che non è influenzata da altre molecole di impurità che possono essere presenti nel campione. L'intensità della fluorescenza è proporzionale alla concentrazione delle molecole target nel campione.

Tabella 1. Confronto dei metodi di quantificazione degli acidi nucleici più diffusi

Bersaglio	ABS UV (Nanodrop)	DNA Qubit HS	DNA di Qubit BR	Qubit RNA	DNA ss del qubit
Tipo di acido nucleico	DNA, RNA	DNA duale	DNA duale	RNA	ssDNA, oligo
Concentrazione del campione (ng/μL)	Da 2 ng/μL a 15 μg/μL	10 pg/µL-100 ng/µL	Da 0,1 ng/µL a 1000 ng/µL	250 pg/µl-1000 ng/µl	50 pg/μL-200 ng/μL
Vantaggio	Limite superiore di quantificazione	Buona specificità	Ampia gamma di quantificazione	Altamente selettivo per l'RNA	Ben tollerato
Limitazioni	Scarsa specificità	Proteggere dalla luce durante l'uso	Proteggere dalla luce durante l'uso	Proteggere dalla luce durante l'uso	Scarsa specificità e lega anche dsDNA

L'assorbanza UV e la quantificazione fluorometrica Qubit hanno ciascuna i loro vantaggi e possono completarsi a vicenda. Per la quantificazione preliminare di campioni di acido nucleico di routine per determinare concentrazione, purezza e presenza di contaminanti, è possibile scegliere il metodo di quantificazione dell'assorbanza. La quantificazione dei qubit è più adatta per campioni preziosi a bassa concentrazione o per la quantificazione precisa richiesta per esperimenti a valle, come il sequenziamento di nuova generazione e la PCR quantitativa in tempo reale.

Sììì ha lanciato diversi prodotti di quantificazione Qubit: dsDNA HS Assay Kit per Qubit^® (Cat#12640), pronto all'uso: 1× kit di analisi dsDNA HS per Qubit^® (Cat#12642), kit di analisi ssDNA per Qubit^® (Cat#12645) e il kit di analisi dsDNA BR (Cat#12643), che hanno ricevuto grandi consensi sin dal loro lancio.

Soluzione 1 Quantificazione ad alta sensibilità dsDNA HS

Premiscela di quantificazione dsDNA pronta all'uso: 1× kit di analisi dsDNA HS per Qubit^®

^{Facile da usare: premiscelato pronto all'uso, non necessita di premiscelazione;}

^{Elevata sensibilità: concentrazione rilevabile fino a 50 pg/μL;}

^{Buona stabilità: il segnale di fluorescenza dura 3 ore e la conservazione a temperatura ambiente per 20 giorni non influisce sulla precisione della quantificazione;}

^{A. Eccellente stabilità: la conservazione a temperatura ambiente per 2 settimane mantiene comunque la stabilità (il valore misurato si discosta dal valore teorico di meno del 10%).}

Tabella 2. Test di stabilità di diversi campioni a 4°C e a temperatura ambiente rispetto ai concorrenti

Reagenti quantitativi	Determinato concentrazione di λDNA（ng/μL）
	0 giorni		1 giorno		3d	7 giorni			10 giorni		14d
T* 4℃	0,51		0,496		0,524	0,534			0,495		0,499
Sììì 4℃	0,51		0,508		0,513	0,475			0,48		0,495
Sììì temperatura ambiente magazzinaggio	0,51		0,517		0,506	0,486			0,506		0,523
Reagenti quantitativi	Determinato concentrazione del gDNA del vitello (ng/μL)
	0 giorni	1 giorno		3d			7 giorni	10 giorni		14d
T* 4℃	55.3	53.5		55,40			57.9	55,8		58
Sììì 4℃	59,4	55,4		57.8			56.1	56.3		59,8
Sììì temperatura ambiente magazzinaggio	59	55.7		61.3			58	58.7		56.1

B. Elevata sensibilità, buona stabilità da lotto a lotto

Tabella 3.Test di stabilità di diversi lotti

Battaccare	Campione	L*			Sììì			errore
		concentrazione1（ng/μL）	concentrazione2（ng/μL）	Media (ng/μL)	concentrazione1（ng/μL）	concentrazione2（ng/μL）	Media (ng/μL)
D9801060	λDNA	0,3160	0,3250	0,3205	0,320	0,320	0,320	0,16%
D8801050		0,3310	0,3320	0,3315	0,319	0,306	0,3125	5,73%
D7813110		0,345	0,358	0,352	0,334	0,329	0,332	-6,03%

Soluzione 2 dsDNA BR Broad Range Quantification

Quantificazione dsDNA ad ampio spettro: kit di analisi dsDNA BR

Elevata sensibilità: concentrazione rilevabile fino a 50 pg/μL;

Eccellente linearità: Buona linearità nell'intervallo 2-1000 ng;

Forte tolleranza ai contaminanti: può tollerare i contaminanti più comuni.

Tabella 4. Stabilità e tolleranza ai contaminanti rispetto ai concorrenti

Sììì Brasile						T* Brasile
standard	RFU1	RFU2	Media	errore		standard	RFU1	RFU2	Media	errore
S1	159,63	160.71	160.17	1%		S1	216.17	211.56	213.865	-2%
S2	24497.0	25078.64	24787.82	2%		S2	20532.46	20452.26	20492.36	0%
misurazione						misurazione
Contaminante	Concentrazione in campione da 10 μL	concentrazione1	concentrazione2	Media	Da testare/controllare	Contaminante	Concentrazione in campione da 10 μL	concentrazione1	concentrazione2	Media	Da testare/controllare
Controllo (H2L)	/	49	48.6	48,8	0,0%	Controllo (H2L)	/	49,8	48	48.9	0,0%
BSA	1 mg/ml	51.8	52	51.9	6,4%	BSA	1 mg/ml	54	51.2	52.6	7,6%
Etanolo	20%	44.6	44	44.3	-9,2%	Etanolo	20%	44,8	43.4	44.1	-9,8%
cloroformio	4,00%	49.0	49,8	49.4	1,2%	cloroformio	4,00%	50.0	47	48.5	-0,8%
Scheda di sicurezza	0,2%	46.6	45,8	46.2	-5,3%	Scheda di sicurezza	0,2%	53.2	51.6	52.4	7,2%
Trition-X100	0,20%	41.6	40.6	41.1	-15,8%	Trition-X100	0.20%	53	51	52.0	6,3%
dNTP	2 mm	44.2	45	44.6	-8,6%	dNTP	2 mm	47.8	46.4	47.1	-3,7%

Soluzione 3 Quantificazione ssDNA

La scelta ideale per la quantificazione dell'ssDNA: kit di analisi dell'ssDNA ad alto costo-prestazioni per Qubit^®

^{Elevata sensibilità: concentrazione rilevabile fino a 50 pg/μL;
Eccellente linearità: Buona linearità nell'intervallo 0-200 ng;
Segnale stabile: l'eccellente colorante combinato con il tampone ottimizzato e migliorato può mantenere un'intensità di fluorescenza stabile a temperatura ambiente ed è altamente applicabile anche in ambienti con inquinamento comune come sali, nucleotidi liberi, solventi, detergenti o proteine, garantendo una quantificazione accurata;
Buona stabilità: nessuna variazione significativa delle prestazioni dopo 6 mesi di trattamento a 4°C o 25°C;
Ampio campo di applicazione: processo operativo semplice, che consente la rapida quantificazione di oligonucleotidi, primer, DNA denaturato, DNA circolare a singolo filamento, ecc.}

A. Buona ripetibilità: quantificazione in diversi strumenti Qubit, diversi tipi di campioni utilizzando Sììì più lotti di Cat#12645 testati. Nell'intervallo 0-200ng, buona ripetibilità nelle misurazioni da diversi strumenti Qubit.