CHO Kit de détection des résidus d'ADN des cellules hôtes (3G)
Sommaire de la qualification (n° de cat. : 41332ES60)
- Arrière-plan
Les données résumées dans ce rapport sont réalisées par Yeasen Biotechnology pour CHO Kit de détection des résidus d'ADN de cellules hôtes (3G). Les données récapitulatives sont uniquement fournies à titre de référence pour l'utilisateur, et l'utilisateur doit vérifier les résidus de cellules hôtes La méthode ADN utilisant leurs propres échantillons pour confirmer que la méthode peut répondre aux exigences de l'utilisateur. Il est recommandé à tous les laboratoires qui utilisent ce kit de vérifier les paramètres suivants : linéarité, plage, exactitude, précision, limite de quantification, spécificité et robustesse.
Yeasen Biotechnology peut fournir le rapport de qualification détaillé pour ce kit. Si l'utilisateur utilise ce rapport, seules les données d'adéquation (qui incluent la précision, Précision et spécificité) doivent être vérifiées.
- Matériel et méthodes expérimentales
2.1 CHO Kit de détection de résidus d'ADN de cellules hôtes (3G), fournisseur : Yeasen, n° de référence : 41332ES60.
2.2 Kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel magnétique MolPure, fournisseur : Yeasen, n° de référence : 18461ES60.
2.3 Données originales : la version électronique a été enregistrée dans le « Rapport d'expérience » le sous-fichier du fichier parent CHO Kit de détection de résidus d'ADN de cellules hôtes (3G).
2.4 Méthodes : Les matériaux et les méthodes de fonctionnement utilisés pour l'expérience ont été essentiellement produits ou définis par Yeasen Biotechnology, qui ont été évalués et vérifiés pendant une longue période, le développement et la fabrication du kit sont suivis du système ISO 13485.
- Contenu et résultats des qualifications
3.1 Plage de détection
La plage linéaire du kit était de 3 fg/μL~300 pg/μL avec R2=1, et l'efficacité d'amplification était de 99,09 % avec un CV < 15 % pour chaque test de concentration.
Figure 1 Courbe standard de la qPCR de l'ADN CHO (3G)
3.2 Précision
3.2.1 Rrécupération
3.2.1.1 Expérience de récupération de dopage d'échantillon vierge
Échantillons de CHO Normes ADN à hautes et faibles concentrations : 30 pg/μL, 300 fg/μL et 3 fg/μL ont été préparés, respectivement, et dosés après extraction à l'aide de la méthode des billes magnétiques pour le kit de prétraitement des échantillons d'ADN résiduel (3 des réplications d'extraction ont été effectuées pour chaque échantillon, et 3 réplications d'analyse ont été effectuées pour chaque extraction), et les récupérations d'échantillons et les CV ont été analysés.
Pour différentes concentrations d’échantillons d’ADN, les récupérations variaient de 70 % à 130 %, et les CV étaient tous < 20 %.
| Type d'échantillon | Concentration théorique | Extrait 1 moyenne | Extrait 2 moyenne | Extrait 3 moyenne | Concentration moyenne | CV | Récupération |
| Échantillon vierge | / | / | / |
| / | / | / |
| Exemple de récupération 1 | 30 pg/μL | 27.07 | 27.51 | 28.27 | 27,62 | 2,20% | 92,06% |
| Exemple de récupération 2 | 300 fg/μL | 285,53 | 301,25 | 295,71 | 294.16 | 2,71% | 98,05% |
| Exemple de récupération 3 | 3 fg/μL | 3,50 | 3.54 | 3.31 | 3.45 | 3,56% | 115,00% |
Tableau 1 Récupération de dopage d'échantillon vierge
3.2.1.2 Expérience de récupération d'échantillons de dopage simulés
Des échantillons de la même concentration (300 fg/μL d'ADN CHO) ont été extraits (3 réplicats d'extraction ont été effectués pour chaque échantillon et 3 réplicats d'analyse ont été effectués pour chaque extraction) avec 5 solutions de fond différentes (teneur élevée en protéines, teneur élevée en acides nucléiques, pH élevé et bas, teneur élevée en sel) et les récupérations d'échantillons et les CV ont été analysés.
Les récupérations d'échantillons d'ADN pour différentes solutions de fond variaient de 70 % à 130 %, avec tous les CV < 20 %.
| Type d'échantillon | Concentration théorique | Extrait 1 moyenne | Extrait 2 moyenne | Extrait 3 moyenne | Concentration moyenne | CV | Récupération |
| Exemple de base | / | / | / |
| / | / | / |
| Riche en protéines | 300 fg/μL | 302,29 | 332,86 | 342,76 | 325,97 | 6,47% | 108,66% |
| Acide nucléaire élevé | 284,47 | 290,66 | 308,76 | 294,63 | 4,28% | 98,21% | |
| Teneur élevée en sel | 272,96 | 286,25 | 312,91 | 290,71 | 7,00% | 96.90% | |
| pH élevé | 296.04 | 320,58 | 324,56 | 313,72 | 4,92% | 104,57% | |
| pH faible | 314,77 | 327,89 | 340.26 | 327,64 | 3,89% | 109,21% |
Tableau 2 Récupération de dopage d'échantillons de base
3.3 Précision
3.3.1 Répétabilité
Répétez le test 10 fois pour les standards d'ADN CHO à une concentration de 3 fg/μL avec un CV < 15 %.
| Répétitions | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Signifier | CV% |
| Valeur de détection (fg/μL) | 3.13 | 3.26 | 2,89 | 3.16 | 2,95 | 2,87 | 2,88 | 2,75 | 2,87 | 3.15 | 2,99 | 5,65% |
Tableau 3 Résultats de répétabilité
3.3.2 Précision intermédiaire
Trois expérimentateurs ont testé indépendamment des échantillons standards d'ADN CHO à des concentrations élevées et faibles : 300 pg/μL, 3 pg/μL et 3 fg/μL, et trois répétitions ont été effectuées pour chaque concentration, et les CV des neuf données obtenues étaient < 15 %.
| Exp |
Concentration réelle Concentration théorique | ADN CHO (3G) | ||
| 300 pg/ul | 3 pg/uL | 3 fg/uL | ||
| Exp 1 | Détermination 1 | 302,63 | 2,97 | 3.40 |
| Détermination 2 | 294,54 | 3.01 | 3.14 | |
| Détermination 3 | 287,67 | 2,99 | 3.01 | |
| Exp2 | Détermination 4 | 292,27 | 2.92 | 3.47 |
| Détermination 5 | 299,61 | 2,90 | 2.82 | |
| Détermination 6 | 305,73 | 2.93 | 2,90 | |
| Exp 3 | Détermination 7 | 301.06 | 3.17 | 3.15 |
| Détermination 8 | 299,17 | 3,00 | 3.21 | |
| Détermination 9 | 290,66 | 2,90 | 3.05 | |
| / | Signifier | 297.04 | 2,98 | 3.13 |
| / | CV% | 2.03 | 2,80 | 6,85 |
Tableau 4 Résultats de précision intermédiaire
3.4 Spécificité
L'interférence de l'ADN génomique cellulaire couramment utilisé dans la production de produits biologiques a été évaluée pour l'interférence avec les réactifs de détection d'ADN CHO, et le groupe d'interférence chevauchait le groupe témoin et aucune interférence n'a été observée (la figure ci-dessous montre, dans l'ordre, les données d'interférence des ADN génomiques de souris, MDCK, HEK293 et E.coli avec les réactifs de détection d'ADN CHO).
Figure 2 Résultats de l'expérience d'interférence
3.5 Limite de quantification
L'ADN de CHO a été détecté à 3 fg/μL, 1 fg/μL, 0,5 fg/μL, 0,3 fg/uL et 0,1 fg/μL, avec 10 réplicats pour chaque concentration. Les résultats ont montré que le CV était < 20 % à des concentrations de 0,3 fg/μL et plus. Autrement dit, la limite de quantification du kit de détection des résidus d'ADN de cellules hôtes CHO (3G) était de 0,3 fg/μL.
|
Répétitions Élément de test | ADN CHO (3G) (fg/μL) | |
| Quantité | Taux de recalcul% | |
| 1 | 0,28 | 93,33% |
| 2 | 0,26 | 86,67% |
| 3 | 0,32 | 106,67% |
| 4 | 0,30 | 100,00% |
| 5 | 0,33 | 110,00% |
| 6 | 0,23 | 76,67% |
| 7 | 0,29 | 96,67% |
| 8 | 0,37 | 123,33% |
| 9 | 0,31 | 103.33% |
| 10 | 0,28 | 93,33% |
| Signifier | 0,30 | / |
| CV% | 13,09% | / |
Figure 3. Résultat du test qPCR ADN CHO (3G)
3.6 Limite de détection
L'ADN de CHO a été détecté à 0,3 fg/μL, 0,1 fg/μL, 0,05 fg/μL et 0,01 fg/μL, avec 20 réplicats pour chaque concentration. Les résultats ont montré que le taux de détection était ≥ 19 (c'est-à-dire un taux de détection ≥ 95 %) dans 20 puits répliqués à des concentrations de 0,05 fg/μL et plus. Autrement dit, la limite de détection du kit de détection de résidus d'ADN de cellules hôtes CHO (3G) était de 0,05 fg/μL.
Figure 4. Résultat du test qPCR ADN CHO (3G)
3.7 Robustesse
Ce kit a été testé et convient, sans toutefois s'y limiter, aux instruments suivants :
| Fournisseur | Modèles d'instruments | Efficacité d'amplification | R2 | Limite de quantification | CV | Limite de détection | Taux de détection |
| Thermo | ABI 7500 | 99,69% | 1 | 0,3 fg/μL | 12,40% | 0,05 fg/μL | 95,65% |
| Thermo | ABI QuantStudio5 | 99,26% | 1 | 0,3 fg/μL | 15,30% | 0,05 fg/μL | 100,00% |
| Roche | LightCycler480 | 2,05% | 0,978 | 0,3 fg/μL | / | 0,05 fg/μL | / |
| Shanghai Hongshi | SLAN | 101,14% | 0,999 | 0,3 fg/μL | 14,41% | 0,05 fg/μL | 95,65% |
Tableau 5 Résultats des tests d'adéquation des instruments
3.8 Stabilité
3.8.1 Stabilité au gel-dégel
Le kit de détection des résidus d'ADN des cellules hôtes CHO (3G) a été testé par congélation et décongélation répétées 10 fois, et les performances du kit n'ont pas été affectées.
|
Indicateurs de test Périodes de gel et de dégel | Paramètre | Heure T0 | Geler-dégeler 10 fois |
| Paramètre de la courbe standard | Efficacité d'amplification | 95,70% | 98,62% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Limite de quantification (0,3 fg/μL) | CV | 15,31% | 17,16% |
| Limite de détection (0,05 fg/μL) | Taux de détection | 95,65% | 100% |
Tableau 6 Analyse des résultats de la stabilité au gel-dégel
3.7.2 Stabilité accélérée
Le kit de détection des résidus d'ADN des cellules hôtes CHO (3G) a été stocké à 2~8°C pendant 30 jours et à 37°C pendant 14 jours, respectivement. Aucune des performances du kit n'a été affectée.
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Indicateurs de test Température et temps d'accélération | Paramètre | Expérience 1 | Expérience 2 | ||
| Heure T0 | 2~8℃ 30 Jours | Heure T0 | 37℃ 14 jours | ||
| Paramètre de la courbe standard | Efficacité d'amplification | 100,53% | 102,61% | 101,76% | 101,84% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Limite de quantification (0,3 fg/μL) | CV | 17,16% | 12,63% | 16,27% | 12.49 |
| Limite de détection (0,05 fg/μL) | Taux de détection | 95,65% | 100% | 95,57% | 100% |
Tableau 7 Analyse accélérée des résultats de la stabilité
3.9 Limite de blanc
3.9.1 Aucun contrôle de modèle (NTC)
Aucun contrôle de modèle (NTC) n'était la dilution d'ADN avec 96 répétitions pour effectuer un test quantitatif qPCR, toutes les valeurs CT au-dessus des 96 puits répliqués testés étaient > 40.
Figure 5 Résultats de l'expérience NTC
3.9.2 Échantillon de contrôle d'extraction négatif (NCS)
L'échantillon de contrôle d'extraction négatif (NCS) était la dilution d'ADN, et il a d'abord été extrait par prétraitement de l'échantillon, puis une qPCR a été effectuée, toutes les valeurs CT supérieures aux 48 puits répliqués testés étaient > 40.
Figure 6 NCS résultats de l'expérience
- 4.Référence
4.1 Commission de pharmacopée chinoise (ChPC). Pharmacopée de la République populaire de Chine (Vol Ⅲ) [S]. Pékin : China Medical Science and Technology Press, p. 542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007 : Principes généraux pour l'examen technique de la validation des méthodes analytiques pour le contrôle qualité des produits biologiques.
4.3 ICH(2022)《Validation de la méthode analytique Q2》, version préliminaire.
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