En los últimos años, el desarrollo y la aplicación de la tecnología de ARNm han seguido atrayendo la atención. Los fármacos de ARNm implican la inoculación de ARNm que codifica proteínas antigénicas en el cuerpo humano. Al utilizar el material genético dentro de las células humanas, expresan y sintetizan proteínas antigénicas. Este proceso induce y activa el sistema inmunológico del cuerpo a través de proteínas antigénicas, con el objetivo de prevenir y tratar enfermedades. Los fármacos de ARNm tienen ventajas como la seguridad, la eficiencia y un ciclo corto. Pueden inducir simultáneamente la inmunidad humoral y celular y se han aplicado en diversas indicaciones, incluidos tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades raras, enfermedades cardiovasculares y más.
Todo el proceso de desarrollo de fármacos de ARNm se puede dividir aproximadamente en varios pasos:
Determinación y diseño de secuencias: transcripción in vitro de ARNm, preparación de encapsulación
El convencional Los pasos de la transcripción in vitro (IVT) de ARNm incluyen:
Extracción y linealización de ADN plasmídico—Purificación del ADN plasmídico—Transcripción in vitro (protección cotranscripcional)—Purificación—Solución madre de ARNm
El una olla El proceso de transcripción in vitro (IVT) de ARNm incluye:
Extracción y linealización de ADN plasmídico—Transcripción in vitro (protección cotranscripcional)—Purificación—Solución madre de ARNm
Actualmente, la mayoría de los procesos existentes implican un solo paso de purificación del ADN plasmídico después de la escisión enzimática antes del paso de transcripción in vitro. Yeasen Biotechlogy, basándose en un centro de desarrollo de aplicaciones de ARNm maduro, ha desarrollado el proceso de "transcripción de ARNm en un solo paso". En este proceso, el ADN plasmídico circular no se purifica después de la escisión enzimática; en cambio, se utiliza directamente para la transcripción in vitro, lo que da como resultado una solución madre de ARNm de alta calidad. Todo este proceso, al tiempo que garantiza la calidad del producto y del proceso, acorta la duración del proceso existente.
Ventajas del proceso:
- Optimización de procesos, reduciendo los pasos de IVT para una operación más sencilla.
- Menores costos de material, eliminando la necesidad de purificación posterior a la escisión e inspección de calidad.
- Manteniendo la calidad y el rendimiento del ARNm.
Datos:
1. Rendimientos y Integridad:
Usando el Con 1 μg de plásmidos linealizados de 2K, 4K y 9K, el proceso de un solo paso puede generar entre 150 y 200 μg de ARNm.
| Longitud | Rendimientos | Integridad |
| 2K | 200 microgramos | 94,00 % |
| 4K | 185 microgramos | 92,20 % |
| 9K | 150 μg | 87,50 % |
Se realizó una prueba de integridad mediante electroforesis capilar (CE) para evaluar la integridad de fragmentos con longitudes de 2K, 4K y 9K. La integridad de los fragmentos de 2K y 4K fue >92%, y la integridad de los fragmentos de 9K fue >87%.
2. Detección de la eficiencia de la protección del ARNm
Se empleó LC-MS para evaluar la eficiencia de recubrimiento de la secuencia 2K, revelando una eficiencia de recubrimiento del 99,5%.
Imagen superior: Cromatograma UV HPLC
Imagen inferior: Espectro de peso molecular deconvolucionado
3. Detección de la eficiencia de la poliadenilación del ARNm
Se utilizó LC-MS para detectar la eficiencia de poliadenilación de las muestras, mostrando resultados distribuidos normalmente.
Imagen superior: Cromatografía líquida Cromatograma TIC
Imagen inferior: Espectro de peso molecular deconvolucionado
4.Expresión de ARNm Ensayo
Transfección de células 293T con productos de ARNm sintetizados utilizando tanto convencional proceso (A la izquierda, plásmidos linealizados) el(con purificación) y el proceso de una sola olla (derecha, plásmidos linealizados sin purificación) no mostró diferencias en la expresión de proteínas de fluorescencia después de 24 horas de cultivo.
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