Figur 1. Skematisk diagram af DNase I-spaltende dsDNA i nærvær af Mg²⁺ og Mn²⁺

Almindelig DNase I er primært oprenset fra bovin bugspytkirtel eller er et rekombinant enzym. Sammenlignet med DNase I oprenset fra bovin bugspytkirtel har rekombinant DNase I relativt lavere endogene RNase-niveauer eller kan formuleres som RNase-frie produkter, hvilket gør det mere egnet til RNase-følsomme anvendelser, såsom fjernelse af DNA fra RNA-prøver.

Ansøgninger

Med hensyn til applikationer er DNase I velkendt for dets anvendelse i eksperimenter relateret til opretholdelse af RNA-integritet, såsom ekstraktion af RNA fri for DNA, fremstilling af RNA-skabeloner uden gDNA før omvendt transkription og nedbrydning af DNA-skabeloner efter in vitro-transkription. Derudover kan den bruges til at fordøje DNA-prober i rRNA-fjernelse, til DNA-mærkning gennem nick-translation, analyse af DNA-protein-interaktioner ved hjælp af footprinting-metoden, generering af tilfældige DNA-biblioteker, reduktion af viskositeten af ​​cellelysater eller proteinekstrakter, fordøjelse af celleadhæsioner som et additiv i cellekultur og delvist TUNEL-kontrol til genomisk clea-analyse til DNA-analyse. apoptose påvisning. Sammenfattende kan DNase I bruges i næsten enhver applikation, der kræver enzymatisk fordøjelse af DNA. Nedenfor vil der blive givet en kort introduktion til flere almindelige applikationer.

• Fjernelse af gDNA før RNA-ekstraktion eller revers transkription

RNA, som en almindeligt studeret prøve i laboratorier, påvirker i høj grad kvaliteten af ​​eksperimentelle data på grund af dens egen kvalitet. Det er generelt umuligt helt at undgå rester af gDNA under RNA-ekstraktionsprocessen. Før du udfører udfordrende downstream-applikationer (såsom mRNA-ekspressionsanalyse, transkriptomanalyse osv.), anbefales det derfor normalt at behandle RNA-prøver med DNase I for at fordøje resterende gDNA. Fordøjelsen af ​​gDNA kan udføres under RNA-ekstraktion, efter RNA-ekstraktion eller før RNA-revers transkription.

Figur 2. DNase I-baseret gDNA-fjernelsesproces

• Fjernelse af template DNA i in vitro transkription

In vitro transkription (IVT) bruger primært DNA som skabelon til at producere RNA under påvirkning af passende substrater og buffere. Almindeligt anvendte RNA-polymeraser i denne proces omfatter T7, T3 og SP6, som er ansvarlige for at katalysere RNA-syntese. Det syntetiserede RNA-produkt kan dog indeholde DNA-rester, og eliminering af disse rester er fordelagtigt for downstream-eksperimenter.

Især i udviklingsprocessen af ​​mRNA-vacciner er fjernelse af disse DNA-rester et kritisk trin, der direkte påvirker vanskeligheden ved efterfølgende oprensningsprocesser og renheden af ​​det endelige produkt.For effektivt at eliminere template-DNA bruges DNase I typisk til behandling for at sikre, at RNA-prøven er fri for DNA-rester, et trin, der hjælper med at forbedre eksperimentets overordnede nøjagtighed og effektivitet.

Figur 3: In vitro transkriptionsproces under anvendelse af lineariseret plasmid som skabelon^[4]

• rRNA-fjernelse i RNA-bibliotekskonstruktion og -sekventering

I organismer er rRNA meget rigeligt og meget konserveret, hvilket er af ringe betydning for at opnå biologisk informationsforskning. Imidlertid er 95% af det samlede RNA ekstraheret under eksperimenter humant rRNA, og tilstedeværelsen af ​​disse rRNA'er kan interferere med påvisningen af ​​mål-RNA'er. Derfor fjernes rRNA ved forberedelse og sekventering af RNA-bibliotek normalt først. I øjeblikket er den vigtigste metode til rRNA-fjernelse RNAase-fordøjelse, og dens vigtigste operationelle trin og principper er som følger:

1. Ekstraher total RNA;
2. Hybridiser enkeltstrengede DNA-prober med rRNA-molekyler (Bemærk: Design og syntetiser rRNA-specifikke enkeltstrengede DNA-prober);
3. RNase H nedbryder det hybridiserede rRNA;
4. DNase I nedbryder DNA-proberne;
5. rRNA fjernes med succes og efterlader ikke-rRNA RNA-skabeloner.

Figur 4: Skematisk diagram af rRNA-fjernelsesprincippet baseret på enzymatisk metode^[5]

• Nick-oversættelse til DNA-mærkning

Nick-oversættelse er den mest almindeligt anvendte metode til mærkning af deoxyribonukleinsyreprober i laboratoriet. Denne metode opnås gennem den kombinerede virkning af DNase I og E. coli DNA polymerase I.

Hovedprincippet er som følger:

1. Brug først en passende koncentration af DNase I til at skabe flere enkeltstrengede nicks i hver streng af det dobbeltstrengede DNA, der skal mærkes, og danner 3'-hydroxyltermini ved nick-stederne.
2. Brug derefter 5'→3' exonukleaseaktiviteten af coliDNA-polymerase I for at fjerne et nukleotid fra 5'-enden af ​​nicket, mens 5'→3'-polymeraseaktiviteten af E. coli DNA-polymerase I introducerer et mærket nukleotid til 3'-enden af ​​nicket for at reparere det. Når nicket bevæger sig langs DNA-strengen, inkorporeres de mærkede nukleotider i den nyligt syntetiserede DNA-streng.

Figur 5: Skematisk diagram af princippet om DNA-mærkning ved nick-translation^[6]

• DNase I footprinting assay eksperiment

DNase I footprinting-assayet er en præcis metode til at identificere bindingsstederne for DNA-bindende proteiner på DNA-molekyler. Princippet er, at proteiner bundet til et DNA-fragment beskytter den bundne region mod at blive nedbrudt af DNase I. Efter enzymatisk fordøjelse kan det resterende fragment ("fodaftrykket") bruges til at bestemme dets sekvens. I gelbilledet er der ingen bånd svarende til de områder, hvor proteinet er bundet.

Hovedprincippet er som følger:

1. Mærk de enkeltstrengede ender af det dobbeltstrengede DNA-molekyle, der skal testes.
2. Bland proteinet med DNA og tilsæt en passende mængde DNase I til enzymatisk fordøjelse, hvilket danner DNA-fragmenter af varierende længde.Mængden af ​​enzym bør kontrolleres for at sikre, at tilstødende DNA-fragmenter kun adskiller sig med ét nukleotid, og en kontrol uden tilsat protein bør inkluderes parallelt.
3. Fjern proteinet fra DNA'et, adskil det denaturerede DNA ved PAGE-elektroforese og autoradiograf for at fortolke nukleotidsekvensen af ​​fodaftryksregionen ved sammenligning med kontrolgruppen.

Figur 6: Skematisk diagram af princippet for DNase I footprinting assay^[7]

De DNase I Udvælgelsesguide for Yeasen

For at imødekomme forskellige applikationsbehov tilbyder Yeasen rekombinant DNase I i E. coli, og kan give GMP-grade DNase I til at opfylde kravene til mRNA in vitro transkription og andre applikationer.

Produktpositionering	Anvendelse	Produktnavn	katalognummer
RNase fri	fjernelse af DNA fra RNA og proteinpræparater	Rekombinant DNase I (RNase-fri)	10325ES
GMP-grad, RNase fri	In vitro transkription af mRNA	UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-kvalitet	10611ES

Referencer

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA og p16INK4a påvisning i hoved- og halskræft: en systematisk gennemgang og meta-analyse [J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Sammenligning af onkogen HPV-typespecifik viral DNA-belastning og E6/E7 mRNA-detektion i cervikale prøver: resultater fra en multicenterundersøgelse [J]. Journal of medicinsk virologi, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Optimering af Dnase I-fjernelse af kontaminerende DNA fra RNA til brug i kvantitativ RNA-PCR[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Fremskridt af in vitro transskriberet mRNA (IVT mRNA) for at muliggøre translation til klinikkerne[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Irreversibel varmeinaktivering af DNase I uden RNA-nedbrydning[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. In situ nick-translation af metafase-kromosomer med biotin-mærket d-UTP[J]. Human genetics, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Valg af en passende metode til identifikation af replikationsoprindelse i mikrobielle genomer. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.