Các loại hạt từ tính khác nhau trong NGS: Hạt từ tính DNA\RNA\mRNA
Hạt từ là một trong những sản phẩm cần thiết trong việc xây dựng các thư viện giải trình tự thông lượng cao. Chúng có thể tinh chế DNA hoặc RNA, sàng lọc các đoạn DNA có kích thước mục tiêu và làm giàu axit nucleic mục tiêu. Với sự phát triển của công nghệ giải trình tự, các hạt từ chuyên dụng trong các lĩnh vực ứng dụng khác nhau đã xuất hiện, bao gồm hạt từ tinh chế DNA, hạt từ lựa chọn kích thước DNA, hạt từ tinh chế RNA và hạt từ làm giàu mRNA. Vậy nguyên lý của các loại hạt từ tính khác nhau là gì? Làm thế nào để lựa chọn?
Yêu cầu mẫu miễn phí và giá thấp hơn khi mua số lượng lớn
1. Hạt DNA
2. Giới thiệu về hạt DNA sao
3. Hạt tinh chế RNA
4. Hạt từ tính giàu mRNA
5.
1. ADN Hạt cườm
1.1 Nguyên tắc cơ bản
Nguyên lý tinh chế axit nucleic bằng hạt từ tính dựa trên sự cố định thuận nghịch pha rắn (SPRI). Trong một số điều kiện nhất định, axit nucleic được liên kết chọn lọc với hạt từ tính, trong khi các chất gây ô nhiễm vẫn còn trong dung dịch. Sau khi áp dụng từ trường, các hạt từ tính liên kết với các phân tử mục tiêu được tách ra khỏi dung dịch, sau đó các hạt từ tính được làm sạch để loại bỏ thêm các chất gây ô nhiễm. Vì sự kết hợp của các hạt từ tính và các phân tử axit nucleic là thuận nghịch, nên axit nucleic có thể được rửa giải khỏi các hạt từ tính bằng dung dịch đệm muối thấp.
Bề mặt ngoài của hạt từ được biến đổi bằng nhóm chức hydroxyl hoặc carboxyl silic. Trong hệ thống đệm tinh chế chứa PEG và các ion muối cao, DNA được liên kết với các hạt bằng cách tạo thành cầu ion của nhóm carboxyl ion muối DNA. Sự liên kết này là có thể đảo ngược. Cầu ion được loại bỏ trong đệm TE mà không có ion PEG và muối, và cuối cùng, DNA được tinh chế. Dựa trên các hạt từ carboxyl, các đầu vào hạt từ và đệm tinh chế khác nhau sẽ liên kết các kích thước mảnh khác nhau. Các hạt từ liên kết ưu tiên các mảnh DNA lớn, vì vậy trong vòng đầu tiên, các hạt từ được sử dụng để liên kết các mảnh lớn hơn mảnh mục tiêu và phần dịch nổi được giữ lại; Trong vòng thứ hai, các hạt từ liên kết các mảnh mục tiêu trong phần dịch nổi và sau đó loại bỏ phần dịch nổi; Cuối cùng, mảnh mục tiêu được rửa giải khỏi các hạt từ, trong đó các mảnh DNA có kích thước mục tiêu.
Hình 1. Cấu trúc hạt từ tính cacboxyl
Hình 2. Nguyên lý tinh sạch DNA bằng hạt từ
1.2 Quy trình hoạt động
Hình 3. Các bước tinh chế DNA
Hình 4. Các bước lựa chọn kích thước DNA
1.3 Mẹo sử dụng hạt từ tính
Năng suất được cải thiện và lựa chọn kích thước chính xác
(1) Trộn đều trước khi sử dụng và cân bằng để hạt từ tính ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 30 phút.
——Độ hòa tan của PEG trong hạt từ tính đệm dễ bị ảnh hưởng bởi độ pH và nhiệt độ.Trước khi sử dụng, cần phải cân bằng đến nhiệt độ phòng để làm các hạt từ tính được phân tán đều và PEG được hòa tan hoàn toàn để tránh ảnh hưởng đến hiệu ứng hấp phụ và tách
(2) Thời gian hấp phụ phải đủ và trộn đều để làm cho sự hấp phụ thích hợp;
(3) Rửa bằng etanol 80% trong quá trình tinh chế hoặc tách;
——Dưới 80% etanol, axit nucleic bị mất nước và tập trung chặt chẽ, không hòa tan. Các enzym, chất đệm, tạp chất còn sót lại trong hệ thống được làm sạch bằng etanol để thu được tinh khiết hơn thư viện.
(4) Trong quá trình lựa chọn kích thước, hãy xác nhận thể tích mẫu để đảm bảo tỷ lệ bổ sung hạt từ là chính xác;
——Trong quá trình lựa chọn kích thước, cần phải nhập chính xác thể tích hạt từ tương ứng để tỷ lệ được chính xác, vì sự thay đổi nồng độ PEG và ion muối trong dung dịch đệm có thể ảnh hưởng đến kết quả.
(5) Trước bước rửa giải, hãy để rượu bay hơi hoàn toàn, nhưng ngăn chặn các hạt từ sấy quá mức
——Thông thường có thể sấy khô trong vòng 2~3 phút. Khi số lượng hạt từ tính lớn và khó sấy khô, Nên vận hành trong nhiều ống ly tâm.
(6) Nếu các hạt từ tính được kết tụ hoặc xếp thành từng tấm, thời gian rửa giải có thể được mở rộng sau khi trộn đều;
——Có thể do tạp chất trong DNA hoặc thời gian sấy quá dài. Nói chung, khi có nhiều tạp chất trong DNA, nên tinh chế trước trước lựa chọn kích thước.
2. Giới thiệu hạt DNA sao
Hạt chọn lọc DNA Hieff NGS™ dựa trên nguyên lý SPRI (bất động hóa đảo ngược pha rắn), sử dụng nguyên liệu hạt từ nhập khẩu và hệ thống đệm tối ưu, có thể được sử dụng để chọn kích thước và tinh chế đoạn DNA trong quá trình xây dựng thư viện NGS. Nó được sử dụng theo cùng cách với hạt AMPure XP đã sử dụng và hiệu quả phục hồi đoạn và phân phối kích thước thư viện rất phù hợp với chúng.
2.1 Giới thiệu về hiệu suất thanh lọc
- Hệ thống đệm độc đáo: Các mảnh DNA xuống tới Có thể phục hồi được 50bp.
- Tỷ lệ phục hồi cao: ≥90%.
- Loại bỏ tạp chất hiệu quả: Loại bỏ hiệu quả các tạp chất như primer dimer, dNTP, muối vô cơ và protein.
- Phạm vi ứng dụng rộng rãi: Thích hợp để tinh chế DNA trong các trường hợp như tiêu hóa bằng enzyme, gắn kết, nhân bản và xây dựng thư viện NGS.
Bảng 1. Hiệu quả tinh chế và thu hồi DNA của hạt từ tính với các tỷ lệ khác nhau
| Nhóm trải nghiệm | Nồng độ thu hồi của hạt từ tính trong lô này (ng/μL) | Tỷ lệ phục hồi | Nhóm hạt AMPure XP (ng/μl) ④ | Tỷ lệ phục hồi | CV% | |||
| Tỷ lệ | ① | ② | ③ | Trung bình | ||||
| 1,8× | 22.2 | 23,4 | 22,8 | 22.8 | 96,92% | 22.2 | 94,37% | 2,55% |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18,5 | 19.33 | 82,19% | 17.8 | 75,67% | 6,52% |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71,42% | 16.2 | 68,87% | 2,55% |
Hình 5. Hiệu quả tinh chế của hạt từ tính kết quả điện di gel agarose
M：Thang DNA 1kb;
2.2 Hiệu suất lựa chọn kích thước
- Dễ ĐẾN hoạt động: nguyên lý tách và hoạt động thử nghiệm hoàn toàn phù hợp với hạt từ XP
- Lựa chọn kích thước chính xác: kích thước của các mảnh được phân loại là chính xác và ổn định
- Khả năng ứng dụng rộng rãi: phù hợp với xây dựng Thư viện DNA và RNA và sự thích nghi để phân mảnh kích thước lựa chọn của các loại mẫu khác nhau
- Hiệu suất chi phí cực cao: chất lượng ổn định, giá cả kinh tế hơn, dịch vụ trước và sau bán hàng chu đáo hơn
Hình 6. Kết quả lựa chọn kích thước DNA
3. Hạt tinh chế RNA
Máy làm sạch RNA Hieff NGS™ dựa trên nguyên lý SPRI, có thể loại bỏ hiệu quả protein, ion muối và các tạp chất khác để thu được các mẫu RNA cô đặc có độ tinh khiết cao và tối ưu hóa cẩn thận hệ thống đệm axit để duy trì sự ổn định của cấu trúc RNA và ngăn ngừa sự phân hủy RNA. Nó phù hợp để xây dựng thư viện RNA, tinh chế các mẫu RNA tổng số sau khi loại bỏ rRNA, tinh chế các sản phẩm RNA được phiên mã trong ống nghiệm, tinh chế các sản phẩm có nhãn RNA, tinh chế RNA tổng hợp, v.v.
- Chất lượng cao: nguyên liệu nhập khẩu, chất lượng ổn định cao
- Hệ thống đệm được tối ưu hóa: đảm bảo độ tinh khiết và toàn vẹn của RNA và ngăn ngừa hiệu quả sự thoái hóa RNA
- Hiệu quả cao: phục hồi hiệu quả, phù hợp cho việc xây dựng thư viện RNA hoặc trong ống nghiệm phục hồi sản phẩm phiên mã, v.v.
Hình 7. Điện di đồ của các mẫu khác nhau sau khi tinh chế
4. Hạt từ tính giàu mRNA
4.1 Nguyên lý phân lập mRNA
Hạt từ tính làm giàu và tách mRNA là hạt từ tính được biến đổi bề mặt bằng oligo (dT). Thông qua nguyên lý lai hóa, chúng có thể liên kết đặc hiệu mRNA với đuôi Poly A và tách mRNA khỏi tổng RNA hoặc tế bào mô một cách đặc hiệu. Bộ dụng cụ này với công thức sản phẩm được tối ưu hóa có thể phân lập hiệu quả mRNA hoàn chỉnh có độ tinh khiết cao từ RNA của tế bào và mô của động vật, thực vật, côn trùng và vi sinh vật nhân chuẩn.
Hình 8.nguyên lý làm giàu và tinh chế hạt từ mRNA
4.2 Hiệu suất hạt phân lập mRNA
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit được phát triển độc lập bởi
- Hiệu quả cao: quá trình tinh chế mRNA có thể hoàn thành trong vòng 45 phút
- Độ tinh khiết cao: hạt từ tính oligo (dT) liên kết đặc hiệu với mRNA
- Đáng tin cậy: mRNA thu được phù hợp cho NGS, trong ống nghiệm dịch thuật, RT-PCR và tổng hợp cDNA
Hình 9. Bộ dụng cụ phân lập mRNA tinh chế mRNA từ các mẫu RNA khác nhau
Lưu ý: năng suất gen quản lý thể hiện tác động của quá trình phục hồi mRNA. Năng suất gen liên quan đến rRNA đặc điểm hiệu quả loại bỏ rRNA
4.3 Câu hỏi thường gặp về hạt từ mRNA
(1) Tại sao hạt từ tính kết tụ và cách giải quyết?
——Hạt từ tính sự kết tụ sẽ làm giảm năng suất và độ tinh khiết của mRNA. Mẫu có thể chứa nhiều tạp chất, chẳng hạn như polysaccharides, protein và DNA chuỗi dài. Những tạp chất này sẽ dẫn đến các hạt từ tính Sự kết tụ. Giải pháp là thổi các hạt từ tính qua một ống nhỏ giọt. DNA bộ gen có thể được loại bỏ bằng cách xử lý DNase trước khi tinh chế. Nếu kích thước mẫu ban đầu quá lớn và vượt quá tải trọng của hạt từ, hạt từ cũng sẽ kết tụ. Nên vận hành theo lượng đầu vào trong hướng dẫn.
(2) Tại sao sản lượng mRNA lại thấp?
——Có nhiều lý do dẫn đến sản lượng mRNA thấp:
- Mức độ biểu hiện mRNA của tế bào hoặc mô thấp, do đó chúng ta có thể chọn mẫu có thời gian biểu hiện thích hợp hoặc tăng lượng RNA tổng số đầu vào của mẫu một cách thích hợp.
- Tỷ lệ hạt từ tính so với mẫu quá thấp, ảnh hưởng đến sự kết hợp của mRNA và hạt từ tính. Cố gắng tăng số lượng hạt từ tính hoặc giảm lượng và thể tích mẫu đầu vào.
- Thời gian lai tạo quá ngắn, có thể tăng thời gian ủ lên 10-15 phút;
- Việc rửa giải không đủ, cần phải tăng thể tích dung dịch rửa giải một cách thích hợp, tăng thời gian và nhiệt độ rửa giải hoặc lặp lại bước rửa giải hai lần.
(3) Làm thế nào để loại bỏ rRNA hiệu quả?
——Nếu thao tác không đúng, rRNA sẽ liên kết không đặc hiệu với các hạt từ tính cùng với mRNA trong quá trình tinh chế, đặc biệt là khi có lượng RNA tổng số đầu vào lớn. Hai vòng liên kết thường được sử dụng trong quá trình thanh lọc để tránh ô nhiễm rRNA một cách hiệu quả. Đảm bảo rằng hỗn hợp được trộn đều trong quá trình rửa để loại bỏ liên kết không đặc hiệu và cố gắng loại bỏ ô nhiễm rRNA.
(4) Đối với nhiều ứng dụng hạ nguồn, liệu có cần phải rửa giải mRNA không và liệu các hạt từ tính có gây trở ngại cho các phản ứng của enzyme hạ nguồn hay không?
——Một số phản ứng hạ nguồn có thể được thực hiện trực tiếp bằng hạt từ tính mà không cần giải phóng mRNA, chẳng hạn như phân mảnh mRNA và phiên mã ngược trong quá trình xây dựng thư viện RNA.Tuy nhiên, nếu phản ứng PCR được thực hiện, cần phải đảm bảo rằng không có ô nhiễm DNA bộ gen, nếu không sẽ tạo ra nhiều đoạn khuếch đại bộ gen, điều này sẽ gây trở ngại cho kết quả thử nghiệm. Các thao tác chi tiết có thể được thực hiện theo hướng dẫn của các phản ứng hạ lưu tương ứng, chẳng hạn như xây dựng thư viện RNA-Seq
(5) Bộ dụng cụ này có thể tách mRNA trực tiếp từ tế bào hoặc mô không?
——Không khuyến khích! Lysate chứa một số thành phần sẽ ảnh hưởng đến sự liên kết của mRNA. Nên sử dụng bộ dụng cụ đặc biệt.
5. Yeasen Khuyến nghị sản phẩm hạt từ tính
Hạt từ tính Hieff NGS™ series như
Bảng 2.
| Tên sản phẩm | Con mèo# | Đặc điểm kỹ thuật | Các tình huống sử dụng và ứng dụng |
| Hieff NGS™ Hạt lựa chọn DNA | 12601ES03 | 1mL | 👉ADN NGS thanh lọc và lựa chọn kích thước 👉Tinh chế sản phẩm PCR 👉Thanh lọc các sản phẩm tiêu hóa và gắn kết của enzyme |
| 12601ES08 | 5ml | ||
| 12601ES56 | 60ml | ||
| 12601ES75 | 450mL | ||
| Hieff NGS™ Chất làm sạch RNA | 12602ES03 | 1mL | 👉tinh chế RNA 👉Làm sạch mẫu RNA tổng số sau khi loại bỏ rRNA 👉Thanh lọc các sản phẩm được gắn nhãn RNA |
| 12602ES08 | 5ml | ||
| 12602ES56 | 60ml | ||
| 12602ES75 | 450mL | ||
| Bộ dụng cụ phân lập mRNA Hieff NGS™ | 12603ES24 | 24 T | 👉cô lập và tinh chế mRNA 👉Tinh chế mRNA phiên mã trong ống nghiệm |
| 12603ES96 | 96 T |
Về Đọc
Bạn biết bao nhiêu về công nghệ liên quan đến NGS?
5 phút để hiểu về quá khứ và hiện tại của hạt lựa chọn DNA (bao gồm phân tích kết quả và giải thích Câu hỏi thường gặp)