I. Principer för Western Blot
Western Blot (WB), eller proteinimmunoblotting, är en klassisk teknik för att detektera specifika proteiner baserad på antigen-antikroppsinteraktioner, allmänt använd inom molekylärbiologi, immunologi och relaterade områden. Dess kärnsteg inkluderar:
- Proteinseparation:
- SDS-PAGE separerar denaturerade proteiner efter molekylvikt.
- SDS täcker proteiner med en enhetlig negativ laddning, vilket eliminerar strukturella influenser.
- Membranöverföring:
- Proteiner överförs från gelén till ett membran (t.ex. PVDF eller nitrocellulosa).
- Antikroppsdetektering:
- Primära antikroppar binder specifikt målproteinet, följt av enzymkonjugerade sekundära antikroppar (t.ex. HRP) som genererar en detekterbar signal, såsom kemiluminescens.
II. Standard arbetsflöde för Western Blot
| Steg | Viktiga procedurer | Rekommenderade reagenser (Yeasen-produkter) |
| 1. Provberedning | Extrahera proteiner med RIPA-lysbuffert; tillsätt PMSF för att hämma proteaser aktivitet. | RIPA Lysis Buffer Series, PMSF |
| 2. Proteinkvantifiering | Använd BCA-metoden (Katt#20200ES) för kvantifiering; matcha standardutspädningsbuffert med provbuffert. | BCA kvantifieringssatser (Katt#20200ES/20201ES) |
| 3. SDS-PAGE Elektrofores | Använd förgjutna geler, kör på 150 V tills färgen når gelbotten. | Pre-cast Gels, SDS-PAGE Loading Buffer |
| 4. Membranöverföring och blockering | Aktivera PVDF-membran (Katt#36125ES) genom blötläggning i metanol under 1 min; överföring vid 300 mA under 60 min i ett isbad; blockera vid rumstemperatur (RT) i 1 timme eller använd snabbblockerande lösning (Katt#36122ES) i 10 min. | Transfer buffert, PVDF-membranserien |
| 5. Antikroppsinkubation | Inkubera med primär antikropp vid 4°C över natten; sekundär antikropp vid rumstemperatur under 1-2 timmar; tvätta med TBST 3x noggrant. | Antikroppspädningsmedel |
| 6.Proteindetektion | Utveckla med ECL (Katt#36208ES). | ECL Chemiluminescence Series |
Figur 1: Western Blot Workflow
III. Vanliga problem och lösningar
| Utfärda | Möjliga orsaker | Lösningar |
| Hög bakgrund  | Ofullständig blockering | Använd ny blockeringslösning och förläng blockeringstiden. |
| Otillräcklig tvätt | Öka tvättfrekvensen och tvätttiden för att ta bort ospecifik bindning. | |
| För hög primär antikroppskoncentration | Späd antikropp till en lämplig koncentration. | |
| Exempel på kvalitetsproblem | Kontrollera provets renhet och kvalitet; använd färska prover. | |
| Membrantorkning | Se till att membranet förblir hydratiserat under inkubationsstegen; säkerställa full kontakt med reaktionslösningar. | |
| Svag eller ingen signal  | Ofullständig överföring | Verifiera överföringseffektiviteten och justera tiden efter behov. |
| Oaktiverat PVDF-membran | Blötlägg PVDF i metanol för att aktiveras innan den överförs till buffert. | |
| Primär antikroppsfelmatchning med målart | Kontrollera databladet, jämför immunogen- och proteinsekvenser och inkludera en allmänt använd positiv kontroll (t.ex. p-aktin i däggdjursceller). | |
| Primär och sekundär antikroppsinkompatibilitet | Se till att sekundär antikropp matchar den primära antikroppens värdart. | |
| Otillräcklig antikroppsbindning | Öka antikroppskoncentrationen och förläng inkubationen vid 4°C (t.ex. över natten). | |
| Låga antigennivåer | Ladda minst 20-30 μg protein per bana; använda proteashämmare och en positiv kontroll. | |
| Lågt målproteinuttryck | Bekräfta uttryck i prov via litteratur/databas; koncentrera provet eller använd en kontroll med högt uttryck. | |
| Icke-specifika band/flera band  | Överpasserade cellinjer förändrar proteinprofiler | Använd lågpassageceller (<15 passager) och kör parallella kontroller med tidig passagestockar. |
| Proteinnedbrytning | Inkludera proteashämmare i lysbuffert; förvara vid -80°C, undvik frys-upptining, använd färska prover. | |
| Post-translationella modifieringar | Kontrollera litteraturen för modifieringar som påverkar bandstorleken (t.ex. ubiquitinering, glykosylering). | |
| Flera skarvvarianter | Verifiera skarvvarianter via litteratur eller databaser. | |
| Proteindimerer/multimers | Tillsätt färsk β-merkaptoetanol eller DTT till SDS-laddningsbuffert. | |
| Exogen proteinkontamination | Kontrollera om det finns exogena proteiner; byta cellinjer om det behövs. | |
| Överdriven provladdning | Optimera belastning (20-30 μg) baserat på måluttryck via gradienttestning. | |
| Multimerbildning | Koka prover i 10 minuter för att dissociera multimerer | |
| Hög primär antikroppskoncentration | Minska koncentrationen och/eller inkubationstiden för att undvika extra band. | |
| Hög sekundär antikroppskoncentration | Lägre koncentration och inkludera en endast sekundär kontroll för att minska ospecifik bindning. | |
| Detektion av orapporterade proteiner eller familjemedlemmar | Granska litteratur eller BLAST; använd rekommenderade cellinjer/vävnader. | |
| Om det är verifierat kan du ha upptäckt ett nytt protein! | ||
| Leende band  | Snabb migrering, hög bufferttemperatur, överbelastning, låg buffert | Långsam migration, förkyld buffert, minska proteinbelastningen, se till att bufferten täcker brunnarna helt. |
| Frowning Band  | Enhetsproblem (t.ex. bubblor under gel) | Justera inställningen för att eliminera bubblor och säkerställa jämn gelpolymerisation. |
| Svansband  | Dålig provlöslighet, nedbrytning, återanvänd buffert | Blanda prover väl, använd färska prover, förbered färsk löpbuffert. |
| Hantelformade band  | Ojämn gel polymerisation, orena prover | Omgjuten gel för enhetlighet; centrifugera prover före användning. |
| Bandsmetande  | Överdriven belastning, dålig gelkvalitet | Minska provvolymen, förbättra gelförberedelsen. |
| Bubbla märken  | Luft instängd under överföringen | Ta bort bubblor när du monterar transfersmörgåsen. |
| Ojämna svarta fläckar  | Oupplöst blockerande lösning, ojämn antikroppsfördelning | Lös blockerande lösning helt, tvätta 3x med TBST, rör om under inkubationen. |
| Vita fläckar  | Hög antikroppskoncentration utarmande substrat | Lägre primära/sekundära antikroppskoncentrationer. |
Ⅳ.Produktval och optimeringsverktyg
Yeasen erbjuder en omfattande uppsättning reagenser för att effektivisera ditt arbetsflöde
Relaterade produkter:
| Förfaranden | Katt. Inga. | Produktnamn | Specifikationer |
| Provberedning | 20101ES | RIPA lysbuffert (stark) | 100 ml |
| 20115ES | RIPA lyseringsbuffert (medium) | 100 ml | |
| 20114ES | RIPA lysbuffert (svag) | 100 ml | |
| 20118ES | Lyseringsbuffert för WB/IP-analyser | 100 ml | |
| BCA Protein Quantification Kit (Enhanced) | 500 T/2500 T/5000 T | ||
| BCA Protein Quantification Kit (Färdigt att använda) | 500 T | ||
| SDS-SIDAN Elektrofores | Gold Band Plus 3-färgs Regular Range Protein Marker (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| GoldBand™ 3-färgs High Range Protein Marker (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | SDS-PAGE Gel Preparation Kit | 1 kit (30~50 geler)/ 1 kit (150~250 geler) | |
| SIDAN Gel Quick Preparation Kit | Koncentrationer: 8 %, 10 %, 12,5 %, 15 % | ||
| 36259ES-36280ES | Precast Protein Plus Gel | Koncentrationer: 8%, 10%, 12%, 4-12%, 4-20% Ladda brunnsalternativ: 10 brunnar, 12 brunnar, 15 brunnar | |
|
Membranöverföring och blockering | 0,45 μm PVDF-membran (1 rulle, 30 cm×3 m) | 1 rulle | |
| 0,22 μm PVDF-membran (1 rulle, 30 cm×3 m) | 1 rulle | ||
| Antikroppsinkubation | 36206ES | Primär och sekundär antikroppsspädningsmedel för WB | 100 ml/500 ml |
|
Proteindetektion | Super ECL-detektionsreagens | 100 ml/500 ml | |
| Enhanced ECL Chemiluminescent Substrate Kit | 100 ml/500 ml |
V.Hur man får support
För personlig felsökning eller protokolloptimering:
- Besök: Yeasen Western Blot produktsida
- E-post: info@yeasenbio.com
Gyllene regeln för framgång: Standardiserade procedurer + reagenser av hög kvalitet + steg-för-steg-validering = reproducerbara WB-resultat!