T7 High Yield RNA Synthesis Kit -10623ES
Rol de afbeelding om in te zoomen Klik op de afbeelding om te zoomen
T7 High Yield RNA Synthesis Kit -10623ES
T7 High Yield RNA Synthesis Kit -10623ES
T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimaliseert het transcriptiereactiesysteem. De kit kan de enkelstrengs RNA efficiënt synthetiseren door T7 RNA-polymerase te gebruiken, het lineaire dubbelstrengs DNA met de T7-promotorsequentie als template, NTP's als substraat om de DNA-sequentie stroomafwaarts van de promoter te controleren. Tijdens transcriptie kunnen gemodificeerde nucleotiden aan het substraat worden toegevoegd om biotine of kleurstofgelabeld RNA te bereiden. Deze kit kan lange transcripten en korte transcripten synthetiseren, RNA kan worden geproduceerd in 100-200 μg met 1 μg DNA-template-input. Het RNA dat door transcriptie wordt gesynthetiseerd, kan worden gebruikt...

Frequently Bought Together

T7 High Yield RNA Synthesis Kit -10623ES

YeasenSKU: 10623ES10
Maat: 10 t
Prijs:
$35.00
Voorraad:
Op voorraad

T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimaliseert het transcriptiereactiesysteem. De kit kan de enkelstrengs RNA efficiënt synthetiseren door T7 RNA-polymerase te gebruiken, het lineaire dubbelstrengs DNA met de T7-promotorsequentie als template, NTP's als substraat om de DNA-sequentie stroomafwaarts van de promoter te controleren. Tijdens transcriptie kunnen gemodificeerde nucleotiden aan het substraat worden toegevoegd om biotine of kleurstofgelabeld RNA te bereiden.

Deze kit kan lange transcripten en korte transcripten synthetiseren, RNA kan worden geproduceerd in 100-200 μg met 1 μg DNA-template-input. Het RNA dat door transcriptie wordt gesynthetiseerd, kan worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen, zoals RNA-structuur- en functieonderzoek, RNase-bescherming, probehybridisatie, RNAi, micro-injectie en in vitro vertaling.

Figuur 1: In vitro RNA-transcriptieproces

Functie

  • Tot 180 μg RNA per reactie uit 1 μg van de controletemplate
  • Geoptimaliseerd reactiesysteem voor het IVT-proces
  • Verminder de dsRNA-productie
  • Hogere RNA-integriteit en -zuiverheid

Sollicitatie

  • In vitro RNA-synthese

Componenten

Componenten nr. Naam 10623ES50 (50 ton) 10623ES60 (100 ton) 10623ES70 (500 ton)
10623-A T7 RNA-polymerase-mix 100 μL 200 μL 1 ml
10623-B 10×Transcriptiebuffer 100 μL 200 μL 1 ml
10623-C ATP (100mM) 100 μL 200 μL 1 ml
10623-D CTP (100 mM) 100 μL 200 μL 1 ml
10623-E GTP (100mM) 100 μL 200 μL 1 ml
10623-F UTP (100 mM) 100 μL 200 μL 1 ml
10623-G Controle DNA-sjabloon (500ng/μL) 10 μL 20 μL 100 μL

Verzending en opslag

Transport van droogijs. Bewaren bij -15℃ ~ -25℃, twee jaar geldig.

Cijfers

Figuur 1. Standaard-RNA werd in vitro gesynthetiseerd met behulp van de T7 RNA-synthesekit.

De reactie werd geïncubeerd in een PCR-instrument bij 37℃ gedurende 2 uur en vervolgens gezuiverd door magnetische kralen (Cat#12602). Het opbrengstresultaat werd geanalyseerd door NanoDrop-spectrofotometer zoals weergegeven in Figuur 1.

Figuur 2. De transcriptiedemonstratie van verschillende lengtes RNA door de T7-kit respectievelijk in het elektroforetogram (Figuur 2A), het capillaire elektroforesediagram (Figuur 2B) en het chromatogram (Figuur 2C)

Figuur 3. Synthese van gecapte RNA in vitro.

De reactie werd geïncubeerd in een PCR-instrument bij 37℃ gedurende 2 uur en vervolgens gezuiverd door magnetische kralen (Cat#12602). Het opbrengstresultaat werd bepaald door een NanoDrop-spectrofotometer zoals weergegeven in Figuur 3A. Het integriteitsresultaat werd geanalyseerd door capillaire elektroforese zoals weergegeven in Figuur 3B.

Documenten:
Veelgestelde vragen:

1. Lage transcriptieopbrengst

De kwaliteit van de template is nauw verbonden met de opbrengst. Als de opbrengst van de experimentele groep significant lager is dan de controlegroep, zijn de mogelijke redenen:

① het experimentele sjabloon bevat remmende componenten;

② Er klopt iets niet in de sjabloon.

Suggesties:

① Reinig de sjabloon opnieuw;

② Bepaal de sjabloonkwantificering en de integriteit ervan;

③ Verleng de reactietijd;

④ Verhoog de hoeveelheid sjablooninvoer;

⑤ Probeer andere promotoren en RNA-polymerasen.

2. Lage opbrengst van korte transcripten

Een kort transcriptie-initiatiefragment zal de reactie remmen. Wanneer het transcriptieproduct minder dan 100 nt is, zal het verlengen van de reactietijd tot 4-8 uur of het verhogen van de hoeveelheid template tot 2 μg de RNA-opbrengst verhogen.

3. De RNA-transcriptielengte is groter dan verwacht

Als uit de elektroforese blijkt dat de productband groter is dan de verwachte grootte, zijn dit de mogelijke redenen:

①Het plasmidesjabloon is mogelijk niet volledig gelineariseerd;

②Het 3'-uiteinde van de sense-streng heeft een opvallende structuur;

③Het RNA heeft een secundaire structuur die niet volledig gedenatureerd is.

Suggesties:

①Controleer of de sjabloon volledig is gelineariseerd en voer indien nodig extra linearisatie uit;

②Selecteer een geschikt restrictie-enzym om 3'-overhangen te voorkomen, of gebruik Klenow Fragment/T4 DNA-polymerase om de transcriptie te voltooien voordat u verdergaat;

③Gebruik gedenatureerde gel om RNA-producten te detecteren.

4. De RNA-transcriptielengte is korter dan verwacht

Als uit de elektroforese blijkt dat de productband kleiner is dan de verwachte grootte, zijn dit de mogelijke redenen:

①Het sjabloon bevat een terminatiesequentie die lijkt op T7 RNA-polymerase;

②Het GC-gehalte in de sjabloon is hoog.

Suggesties:

①Verlaag de reactietemperatuur (bijvoorbeeld 30°C). Soms kan het verlagen van de temperatuur de transcriptielengte vergroten, maar het zal de opbrengst verminderen. Of probeer verschillende RNA-polymerasen voor transcriptie;

②Als het GC-sjabloongehalte hoog is, gebruik dan 42℃ om te transcripteren, of voeg SSB toe om de opbrengst en transcriptielengte te vergroten.

5. Elektroforese-tailing van transcriptieproducten

Er is sprake van een staartverschijnsel tijdens elektroforese.

Mogelijke redenen:

①Verontreinigd met RNase tijdens experimentele operatie;

②Verontreinigd DNA-sjabloon door RNase.

Suggesties:

①Gebruik RNase-vrije pipetpunten en EP-buisjes, draag wegwerphandschoenen en -maskers van latex en alle reagentia worden bereid met RNase-vrij H2O.

②Zuiver het template-DNA opnieuw.

Citaten en referenties:

[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al.Nosema bombycis microRNA-achtige RNA 8 (Nb-milR8) verhoogt de pathogeniciteit van schimmels door de genexpressie van BmPEX16 in zijn gastheer, Bombyx mori, te moduleren. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)

[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Ultragevoelige kwantificering van circulerende miR-195-5p met triple streng displacement amplification cascade. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)

Storage

Dry ice transportation. Store at -15℃ ~ -25℃, valid for two years.

FAQ

The size is 1142 base pairs.
The polyA tail is introduced during the design of the template, while the addition of the cap is done separately.
1. Increase the input ratio of NTP and its analogues; 2. Reasonable application of additives; 3. The reaction temperature can be set at 40 degrees.
The optimization of the IVT system can be achieved by adjusting the template, the amount of T7 enzyme used, and if it is co-transcription with cap addition, the ratio between the cap and NTP can be considered; for enzymatic cap addition, the conditions can be optimized in terms of the dosage of the cap-adding enzyme, 2-O-methyltransferase, and SAM. Regarding the template, apart from the requirement of complete linearization, there is another point, which is sequence design. For example, in the 5'UTR region, pay attention to uAUG and Kozak sequence; for CDS, consider the codon preference, GC3 content, and dinucleotide preference, etc.; 3'UTR: RBP and miRNA binding sites: and another point is the secondary structure of RNA. The stable secondary structure of the 5'UTR pre-sequence will reduce the expression of mRNA; the stable secondary structure of 3'UTR will increase the stability of mRNA and promote the expression of the encoded protein. For the recommended IVT system and more detailed tips, please refer to the mRNA in vitro synthesis experiment manual of Vivian Biotechnology.
When scaling up the 20uL system proportionally to 10mL, the yield should be approximately the same. Usually, we directly scale up from 20uL to 50mL, and the yield is generally at the level of 100ug/20uL. For the 50mL volume, we also use centrifuge tubes and a metal bath for measurement. For the 10mL volume, the amplification effect is generally better. In such cases, it is generally recommended to fine-tune the final concentrations of the enzyme and NTP before trying again.
Regarding the re-submissions from our other clients, based on the CE results measured using Qsep100, the ideal situation is that the CE integrity can reach 88% to 92%; of course, achieving this level usually requires a series of optimizations.
The average yield is between 120-220 ug/ul (the yield is highly dependent on the sequence design). In the co-transcription method, the mRNA yield is 8 g/L. With process optimization, the yield will increase. Currently, the quality parameters of the available processes include observing the fluorescence value of GFP and measuring the cap addition rate using LC-MS.
We can also conduct RNA electrophoresis. The main purpose is to briefly assess the purity of the products and check for any obvious aggregates, etc. If we are looking at the size of the RNA, during the electrophoresis process, we usually add a sample of a clearly defined RNA size as a reference.
Currently, the detection of the template mainly includes items such as sequence integrity, endotoxin, and residual host nucleic acids. There is no clear detection method for RNase yet; or you can refer to the detection method for residual RNase in our enzyme products, which is relatively simple and reliable.
There are several possible reasons for the generation of ds during the IVT process, mainly:
The T7 pol enzyme will use the product RNA as a template and continue to extend the RNA at its 3' end. The extended sequence will form complementary pairing with the 3' end sequence of the original RNA molecule, thereby creating a hairpin structure.
The T7 pol enzyme can use RNA as a template to replicate RNA molecules, and synthesize the complementary strand.
(At present, there is no effective method for removing dsRNA. However, there is a patent report suggesting that a fiber column (sigma) could be tried.)
The suggestions regarding optimizing the IVT system and adjusting the reaction conditions to inhibit dsRNA mainly include the following points:
1. Reduce the concentration of magnesium ions; however, reducing the concentration of magnesium ions will also lead to a decrease in the production of RNA, and a balance point needs to be reached.
2. Increase the reaction temperature of IVT to 50-56℃. This temperature can effectively reduce the content of dsRNA in the product; however, the requirements for equipment for high-temperature reactions will vary, and it may also increase the cost.
3. In the IVT reaction system, certain dispersants such as urea and formamide are added; our process research team has also conducted some experiments on this route, which can achieve the effect of inhibiting dsRNA. However, whether it is suitable for process scaling-up still needs further research.
Internal research has studied this precipitation. It is a polymer composed of magnesium ions, RNA, sodium ions, and magnesium pyrophosphate. There is a coagulation effect, and the aggregates keep growing in size (similar gel-like, flocculent, or particulate precipitations all follow a similar principle). The effects of adding water and adding EDTA are similar, which also supports this statement. Reasons: 1. If the concentration of Mg ions is too high, it will aggregate with pyrophosphate to form magnesium pyrophosphate precipitation. However, it has a coagulation effect, continuously encapsulating nucleic acids to form a gel-like substance, resulting in a decrease in yield. 2. A high RNA production level will also cause precipitation.
This kind of precipitation occurs by chance and is also closely related to the sequence design.
Solution: (1) Reduce the concentration of magnesium ions, but this will result in a decrease in yield. The amount of T7 enzyme needs to be increased and the reaction time (from 2 hours to 3-4 hours) needs to be extended; (2) The form of NTP (the presence of magnesium ions at a high concentration, such as 46 mM, does not select NTP, but when the magnesium ion concentration decreases, the yield of NTP (Tris salt form) does not change much, and the yield of the triNa form of NTP decreases significantly.
You could consider WAVE, Haodao Fu reaction vessels, and Sartorius. The main thing is to find bags that are compatible with the existing IVT system. For the stirring tank, the rotational speed of the propeller also needs to be optimized based on the actual situation, as it is related to the type and size of the blades. It is recommended to consult the equipment manufacturer.
In industry, the most commonly used method for enzymatic cap addition is to treat IVT products with vaccinia virus cap-adding enzyme, which can modify them into Cap 0 mRNA. The Cap 0 structure can be further modified into Cap 1 (m7GpppmN) under the action of 2'O-methyltransferase. With enzymatic cap addition, the cap addition efficiency can reach over 95%. The co-transcription cap addition method is simple to operate, but because GTP competes with the cap dimer, the cap addition rate of this method is a little lower; both methods have their own advantages and disadvantages.
Currently, our system uses a 20-ul reaction volume. The output of in vitro transcription is 100-200 ug. The internal amplification system with a 10 ml volume can reach 50 mg - 100 mg.
It is recommended that the entire reaction time be between 2 and 3 hours. Our company has verified a maximum reaction time of 3 hours, and our cooperative clients have also verified a reaction time of 4 hours, and the results were normal.
No related services are provided. Currently, the main reference for the COVID-19 vaccine is still the publicly available vaccine sequences from external sources, namely BioNtech and Moderna. The main original sequences are generally reliable, except for the incomplete polyA tail; the earlier COVID-19 vaccines developed in China are mostly based on the RBD protein sequences. We haven't obtained the specific sequences for this part; basically, these are the core technologies of each research team.
The capillary column used for adding the cap is from the Agilent series (6230B TOF), while the tailing column used is from Thermo's QE or Waters' Rda.
This reagent kit does not contain the component for poly A tail. In the template preparation stage, the A tail can be attached to the plasmid, and the length is usually between 20 and 200.
Any power rating above 13000 rpm is acceptable.
The precipitate is spermidine. This is a normal phenomenon and it can be dissolved by hand.

Citations

Documents

Manual
10623_Manual_HB230115_EN.pdf
MSDS
10623-MSDS-HB260713.pdf
MSDS-10623-A-T7_RNA_Polymerase_Mix-HB221014.pdf
MSDS-10623-B-10x_Transcription_Buffer-HB221014.pdf
MSDS-10623-C-ATP_100_mM_-HB221014.pdf
MSDS-10623-D-CTP_100_mM_-HB221014.pdf
MSDS-10623-E-GTP_100_mM_-HB221014.pdf
MSDS-10623-F-UTP_100_mM_-HB221014.pdf
MSDS-10623-G-DNA_template-HB221014.pdf

Applications

Misschien vind je het ook leuk

Navraag

FAQ

Het product is alleen bedoeld voor onderzoeksdoeleinden en is niet bedoeld voor therapeutisch of diagnostisch gebruik bij mensen of dieren. Producten en inhoud worden beschermd door patenten, handelsmerken en auteursrechten die eigendom zijn van Yeasen Biotechnologie. Handelsmerksymbolen geven het land van herkomst aan, niet noodzakelijkerwijs registratie in alle regio's.

Voor bepaalde toepassingen zijn mogelijk aanvullende intellectuele eigendomsrechten van derden vereist.

Yeasen is toegewijd aan ethische wetenschap en is van mening dat ons onderzoek kritische vragen moet beantwoorden en tegelijkertijd de veiligheid en ethische normen moet waarborgen.