I. Principes van Western Blot
Western Blot (WB), of proteïne-immunoblotting, is een klassieke techniek voor het detecteren van specifieke proteïnen op basis van antigeen-antilichaaminteracties, die veel wordt gebruikt in de moleculaire biologie, immunologie en verwante vakgebieden. De kernstappen omvatten:
- Eiwit scheiding:
- SDS-PAGE scheidt gedenatureerde eiwitten op basis van moleculair gewicht.
- SDS omhult eiwitten met een uniforme negatieve lading, waardoor structurele invloeden worden geëlimineerd.
- Membraanoverdracht:
- Eiwitten worden vanuit de gel naar een membraan (bijvoorbeeld PVDF of nitrocellulose) getransporteerd.
- Detectie van antilichamen:
- Primaire antilichamen binden zich specifiek aan het doeleiwit, gevolgd door enzymgeconjugeerde secundaire antilichamen (bijv. HRP) die een detecteerbaar signaal genereren, zoals chemiluminescentie.
II. Standaard Western Blot-workflow
| Stap | Belangrijkste procedures | Aanbevolen reagentia ( |
| 1. Monstervoorbereiding | Eiwitten extraheren met RIPA-lysisbuffer; PMSF toevoegen om proteasen te remmen activiteit. | RIPA Lysis Buffer-serie, PMSF |
| 2. Eiwitkwantificering | Gebruik de BCA-methode (Cat.nr. 20200ES) voor kwantificering; pas de standaardverdunningsbuffer aan op de monsterbuffer. | BCA-kwantificeringskits (Cat.nr. 20200ES/20201ES) |
| 3. SDS-PAGE-elektroforese | Gebruik voorgevormde gels en laat ze op 150 V draaien totdat de kleurstof de onderkant van de gel bereikt. | Vooraf gegoten gels, SDS-PAGE-laadbuffer |
| 4. Membraanoverdracht en blokkering | Activeer PVDF-membraan (Cat.nr. 36125ES) door 1 min. in methanol te weken; 60 min. overbrengen bij 300 mA in een ijsbad; 1 uur bij kamertemperatuur (RT) blokkeren of een snelle blokkeringsoplossing gebruiken (Cat.nr. 36122ES) gedurende 10 min. | Trantwoord Buffer, PVDF Membraan Serie |
| 5. Incubatie van antilichamen | Incubeer met primair antilichaam bij 4°C gedurende de nacht; secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur; was grondig 3x met TBST. | Antilichaamverdunningsmiddel |
| 6.Eiwitdetectie | Ontwikkelen met ECL (Cat.nr. 36208ES). | ECL Chemiluminescentie Serie |
Figuur 1: Western Blot-workflow
III. Veelvoorkomende problemen en oplossingen
| Probleem | Mogelijke oorzaken | Oplossingen |
| Hoge achtergrond  | Onvolledige blokkering | Gebruik een nieuwe blokkeringsoplossing en verleng de blokkeringstijd. |
| Onvoldoende wassen | Verhoog de wasfrequentie en -duur om niet-specifieke bindingen te verwijderen. | |
| Overmatige primaire antilichaamconcentratie | Verdun het antilichaam tot een geschikte concentratie. | |
| Problemen met de monsterkwaliteit | Controleer de zuiverheid en kwaliteit van het monster; gebruik verse monsters. | |
| Membraan drogen | Zorg ervoor dat het membraan gehydrateerd blijft tijdens de incubatiestappen en zorg ervoor dat het volledig in contact komt met de reactieoplossingen. | |
| Zwak of geen signaal  | Onvolledige overdracht | Controleer de overdrachtsefficiëntie en pas de tijd indien nodig aan. |
| Niet-geactiveerd PVDF-membraan | Week PVDF in methanol om het te activeren voordat u het overbrengt naar de buffer. | |
| Primaire antilichaammismatch met doelsoort | Controleer het gegevensblad, vergelijk immunogeen- en eiwitsequenties en voeg een veelgebruikte positieve controle (bijv. β-actine in zoogdiercellen). | |
| Primaire en secundaire antilichaamincompatibiliteit | Zorg ervoor dat het secundaire antilichaam overeenkomt met de gastheersoort van het primaire antilichaam. | |
| Onvoldoende antilichaambinding | Verhoog de antilichaamconcentratie en verleng de incubatie bij 4°C (bijvoorbeeld een hele nacht). | |
| Lage antigeenniveaus | Voeg minimaal 20-30 μg eiwit per baan toe; gebruik proteaseremmers en een positieve controle. | |
| Lage doelproteïne-expressie | Bevestig de expressie in het monster via de literatuur/database; concentreer het monster of gebruik een controle met een hoge expressie. | |
| Niet-specifieke banden/meerdere banden  | Overgepasseerde cellijnen die eiwitprofielen veranderen | Gebruik cellen met een lage doorgang (<15 doorgangen) en voer parallelle controles uit met cellen met een vroege doorgang. |
| Eiwitafbraak | Voeg proteaseremmers toe aan de lysisbuffer; bewaar bij -80°C, vermijd invriezen en ontdooien; gebruik verse monsters. | |
| Post-translationele modificaties | Controleer de literatuur op wijzigingen die de bandgrootte beïnvloeden (bijv. ubiquitinatie, glycosylering). | |
| Meerdere splice-varianten | Controleer splicevarianten via literatuur of databases. | |
| Eiwitdimeren/multimeren | Voeg verse β-mercaptoethanol of DTT toe aan de SDS-laadbuffer. | |
| Exogene eiwitverontreiniging | Controleer op exogene eiwitten; wissel indien nodig van cellijn. | |
| Overmatige monsterbelading | Optimaliseer de belasting (20-30 μg) op basis van de doelexpressie via gradiënttesten. | |
| Multimere vorming | Kook de monsters 10 min. om multimeren te dissociëren | |
| Hoge primaire antilichaamconcentratie | Verminder de concentratie en/of incubatietijd om extra banden te voorkomen. | |
| Hoge secundaire antilichaamconcentratie | Verlaag de concentratie en voeg een secundaire controle toe om de niet-specifieke binding te verminderen. | |
| Detectie van niet-gerapporteerde eiwitten of familieleden | Bestudeer de literatuur of BLAST; gebruik aanbevolen cellijnen/weefsels. | |
| Als het geverifieerd is, heeft u mogelijk een nieuw eiwit ontdekt! | ||
| Lachende Banden  | Snelle migratie, hoge buffertemperatuur, overbelasting, lage buffer | Langzame migratie, buffer vooraf koelen, de eiwitbelasting verminderen en ervoor zorgen dat de buffer de wells volledig bedekt. |
| Fronsbanden  | Problemen met het apparaat (bijv. luchtbellen onder de gel) | Pas de instellingen aan om luchtbellen te verwijderen en een gelijkmatige polymerisatie van de gel te garanderen. |
| Staartbanden  | Slechte oplosbaarheid van het monster, degradatie, hergebruikte buffer | Meng de monsters goed, gebruik verse monsters en bereid een verse buffer voor. |
| Haltervormige banden  | Ongelijke gel polymerisatie, onzuivere monsters | Giet de gel opnieuw voor uniformiteit; centrifugeer de monsters vóór gebruik. |
| Band smeren  | Overmatige belasting, slechte gelkwaliteit | Verminder het monstervolume en verbeter de gelbereiding. |
| Bubbelvlekken  | Lucht opgesloten tijdens de overdracht | Verwijder eventuele luchtbellen bij het monteren van de transfer sandwich. |
| Ongelijke zwarte vlekken  | Onopgeloste blokkerende oplossing, ongelijke antilichaamverdeling | Los de blokkeeroplossing volledig op, was 3x met TBST en schud tijdens de incubatie. |
| Witte vlekken  | Hoge antilichaamconcentratie die substraat uitput | Lagere primaire/secundaire antilichaamconcentraties. |
Ⅳ.Productselectie- en optimalisatietools
Gerelateerde producten:
| Werkwijze | Cat.nr. | Productnaam | Specificaties |
| Monstervoorbereiding | 20101ES | RIPA lysisbuffer (sterk) | 100 ml |
| 20115ES | RIPA Lysisbuffer (Medium) | 100 ml | |
| 20114ES | RIPA-lysisbuffer (zwak) | 100 ml | |
| 20118ES | Lysisbuffer voor WB/IP-testen | 100 ml | |
| BCA-eiwitkwantificatiekit (verbeterd) | 500 ton/2500 ton/5000 ton | ||
| BCA-eiwitkwantificatiekit (klaar voor gebruik) | 500 ton | ||
| SDS-PAGE-elektroforese | Gold Band Plus 3-kleuren Regular Range Proteïnemarker (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| GoldBand™ 3-kleuren High Range Proteïnemarker (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | SDS-PAGE Gel-voorbereidingskit | 1 set (30~50 gels)/ 1 set (150~250 gels) | |
| PAGE Gel Snelle Voorbereidingskit | Concentraties: 8%、10%、12,5%、15% | ||
| 36259ES-36280ES | Voorgegoten Proteïne Plus Gel | Concentraties: 8%、10%、12%、4-12%、4-20% Opties voor laadputten: 10 putten, 12 putten, 15 putten | |
|
Membraanoverdracht en blokkering | 0,45 μm PVDF-membraan (1 rol, 30 cm × 3 m) | 1 rol | |
| 0,22 μm PVDF-membraan (1 rol, 30 cm × 3 m) | 1 rol | ||
| Incubatie van antilichamen | 36206ES | Primaire en secundaire antilichaamverdunner voor WB | 100 ml/500 ml |
|
Eiwitdetectie | Super ECL-detectiereagens | 100 ml/500 ml | |
| Verbeterde ECL Chemiluminescentie Substraat Kit | 100 ml/500 ml |
V.Hoe krijg ik ondersteuning?
Voor gepersonaliseerde probleemoplossing of protocoloptimalisatie:
- Bezoek:
Yeasen Western Blot-productpagina - E-mailadres: info@yeasenbio.com
Gouden regel voor succes: Gestandaardiseerde procedures + hoogwaardige reagentia + stapsgewijze validatie = reproduceerbare WB-resultaten!