Apoptose verwijst over het algemeen naar een soort geprogrammeerde celdood die optreedt door de regulatie van intracellulaire genen en hun producten tijdens de ontwikkeling van cellen of onder invloed van bepaalde factoren. Apoptose speelt een belangrijke rol in embryonale ontwikkeling en morfogenese, de stabiliteit van normale celpopulaties in weefsels, de verdediging en immuunreactie van het lichaam, celschade en veroudering veroorzaakt door ziekte of vergiftiging, en het voorkomen en de progressie van tumoren, en heeft potentiële therapeutische betekenis.

De gebeurtenissen in het apoptotische pad vinden plaats in een tijdsvolgorde, dat wil zeggen dat de gebeurtenissen in volgorde plaatsvinden en uiteindelijk leiden tot het ontstaan ​​van apoptotische lichaampjes, waarbij apoptose optreedt.

De typische kenmerken zijn als volgt:

1. Vroege apoptose: veranderingen in de celmembraanstructuur, eversie van fosfatidylserine;

2. Vroege en middelste fase van apoptose: de dichtheid van het cytoplasma nam toe, het mitochondriale membraanpotentiaal verdween, de permeabiliteit veranderde en cytochroom C werd in het cytoplasma vrijgegeven;

3. Late apoptose: apoptose signaaltransductie;

4. Late apoptose: DNA afgebroken tot fragmentgroottes van 180~200 bp.

Figuur 1: Voorkomen en detectie van opeenvolgende gebeurtenissen in het apoptosepad

1. Vroege apoptose: Annexin-V/PI dubbele kleuring (detectie van PS op het extracellulaire membraan)

In normale levende cellen bevindt fosfatidylserine (PS) zich aan de binnenkant van het celmembraan. Wanneer apoptose optreedt, verandert het celmembraan en schakelt PS over van het binnenoppervlak van het celmembraan naar het buitenoppervlak van het celmembraan. Annexin-V is een Ca2+-afhankelijk fosfolipidebindend eiwit met een moleculair gewicht van 35-36 KD, dat met hoge affiniteit kan binden aan PS. Met behulp van Annexin-V gelabeld met fluoresceïne (FITC, Alexa fluor488, etc.) als probe, kunnen apoptotische cellen en levende cellen worden geïdentificeerd door middel van flowcytometrie of fluorescentiemicroscoop.

PS van necrotische cellen zal ook overgaan van het binnenoppervlak van het celmembraan naar het buitenoppervlak van het celmembraan. Annexin-V kan PS ook herkennen op het oppervlak van necrotische cellen, dus Annexin-V kan necrotische cellen niet onderscheiden van apoptotische cellen. Bovendien is propidinejodide (PI) een nucleïnezuurkleurstof, die kan binden aan DNA in cellen, en het kan niet door het volledige celmembraan dringen. Het celmembraan van vroege apoptotische cellen en levende cellen is nog intact, en PI-kleurstof kan de cel niet vrij binnendringen via het celmembraan om te binden met DNA, dus PI-kleurstof kan apoptotische cellen en levende cellen niet labelen, maar PI-kleurstof kan binden met DNA in de cel via het celmembraan van necrotische cellen. PI-kleurstof in de dode cellen zal rode fluorescentie uitzenden na te zijn geëxciteerd door een 488nm laser, en zal worden ontvangen door het corresponderende kanaal. Daarom kunnen Annexin V en PI samen worden gebruikt om levende cellen, vroege apoptotische cellen en necrotische cellen te onderscheiden.

Figuur 2: Analyse van de resultaten van flowcytometrie na annexine-v/pi-dubbelkleuring

Producten bestellen:

2. Vroege apoptose: JC-1-kleuring (detectie van veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal)

Het proces van apoptose gaat vaak gepaard met de vernietiging van het mitochondriale transmembraanpotentieel, wat algemeen wordt beschouwd als een van de vroegste gebeurtenissen in het proces van de apoptosecascade. Het vindt plaats vóór het optreden van de kenmerken van nucleaire apoptose (chromatineconcentratie, DNA-breuk). Zodra het mitochondriale transmembraanpotentieel instort, is celapoptose onomkeerbaar. Het bestaan ​​van mitochondriaal transmembraanpotentieel stelt sommige lipofiele kationische fluorescerende kleurstoffen zoals rhodamine 123, JC-1, JC-10 in staat om zich te binden aan de mitochondriale matrix. De toename of afname van hun fluorescentie geeft de toename of afname van de elektronegativiteit van het mitochondriale binnenmembraan aan.

JC-1 wordt veel gebruikt om het potentieel van het mitochondriale membraan △ΨM te detecteren, waarbij potentiaalafhankelijke accumulatie in mitochondriën wordt aangetoond. In normale mitochondriën aggregeert JC-1 in de mitochondriale matrix om een ​​polymeer te vormen, dat een sterke rode fluorescentie uitzendt (ex=585 nm, em=590 nm); In apoptotische cellen depolariseerde het transmembraanpotentiaal van de mitochondriën, werd JC-1 uit de mitochondriën vrijgegeven, nam de concentratie af en veranderde in de monomeervorm die groene fluorescentie uitstraalde. De kleurverandering weerspiegelt dus direct de verandering in het potentieel van het mitochondriale membraan. De mate van mitochondriale depolarisatie kan ook worden gemeten aan de hand van de verhouding tussen de rood/groene fluorescentie-intensiteit. JC-1-detectie is een veelgebruikte methode.

3. Late apoptose: TUNEL-methode (DNA-fragment in situ-labelmethode)

In het late stadium van apoptose worden een groot aantal kleverige 3-OH-terminals geproduceerd door dubbelstrengsbreuken of enkelstrengsbreuken van chromosomaal DNA. Onder invloed van deoxyribonucleotide terminal transferase (TdT) kan luciferase-gelabelde dUTP worden gebonden aan de 3-terminal van DNA, zodat apoptotische cellen kunnen worden gedetecteerd. Dergelijke methoden worden terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) genoemd. Omdat normale of prolifererende cellen vrijwel geen DNA-breuken hebben, is er geen 3-OH-vorming en kunnen er maar weinig worden gekleurd. TUNEL is in feite een onderzoeksmethode die moleculaire biologie en morfologie combineert. In situ-kleuring van een complete enkele apoptotische kern of apoptotisch lichaam kan de typische biochemische en morfologische kenmerken van apoptose nauwkeurig weerspiegelen. Het kan worden gebruikt om de celmorfologie van in paraffine ingebedde weefselsecties, bevroren weefselsecties, gekweekte cellen en uit weefsel geïsoleerde cellen te bepalen. Ook kan het een zeer klein aantal apoptotische cellen detecteren. Daarom wordt het veel gebruikt bij het onderzoek naar apoptose.

Gerelateerde producten: