절차
1. 세포 수확
80~90% 합류율 의 대수적 성장 단계에서 세포를 수집합니다. 멸균된 원심분리관에 넣습니다.
참고: 세포는 기하급수적으로 성장하는 동안 채취해야 합니다. 세포 상태는 종양 형성 효율에 큰 영향을 미칩니다. 세포주의 종양원성이 낮은 경우, 마트리젤을 주사액에 첨가하여 세포외기질을 보충할 수 있습니다.
2. 세포 준비
세포를 1500 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 1 mL PBS에 재현탁합니다. 세포를 2~3회 세척합니다.
세포를 트립신으로 분해한 후 PBS 또는 무혈청 배지로 중화합니다. 트립신을 제거하기 위해 1~2회 다시 원심분리하고 최종 농도가 1~5 × 10⁸ cells/mL가 되도록 PBS 또는 배지에 재현탁합니다 . 세포 현탁액은 얼음 위에 보관합니다.
참고: 정확한 세포 수를 측정하기 위해 세포 현탁액을 균일하게 혼합하십시오. 트립신 처리 후, 세포를 가능한 한 빨리, 바람직하게는 30분 이내에 누드 마우스의 피하 주사해야 합니다. 많은 횟수의 주사가 필요한 경우, 적시에 이식하기 위해 여러 배치로 나누어 진행하십시오 .
3. 셀-마트리젤 혼합물 제조
세포 현탁액과 마트리젤을 얼음 위에서 1:1 비율로 혼합하여 최종 농도가 1–5 × 10⁷ cells/mL가 되도록 합니다 . 주사 전까지 얼음에 보관합니다.
주입 직전에 피펫으로 세포 덩어리를 분산시키고 균일하게 분포되도록 철저히 섞습니다.
메모: 세포 대사를 줄이고 조기에 겔화되는 것을 방지하려면 혼합물을 차갑게 유지하세요.
4. 피하주사
혈액 공급이 좋은 부위(예: 뒷겨드랑이 또는 사타구니 부위) 에 100~200 µL 의 세포-마트리젤 현탁액을 피하 주사합니다 .
엄지와 검지로 어깨와 등 위쪽 피부를 살짝 눌러 쥐가 주사기를 차는 것을 방지합니다. 쥐를 똑바로 세운 자세로 잡고 주사 부위 등쪽 피부를 75% 에탄올에 적신 면봉으로 2~3회 소독합니다.
5. 주입 기술
근육을 피하고 피하 공간 에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다 . 세포 현탁액을 천천히 주입합니다. 누출을 최소화하기 위해 바늘을 빼기 전에 몇 초 정도 기다립니다.
참고: 주사 전 주사기 내 공기를 모두 제거하십시오. 주사 바늘을 피부 아래 약 1cm 깊이로 삽입하고, 주사 전 바늘이 진피층이나 근육층에 있지 않은지 살짝 움직여 확인하십시오. 바늘이 자유롭게 움직이면 피하층에 있는 것입니다 .
6. 주입 후 모니터링
쥐를 우리에 다시 넣고 생존 여부, 종양 성장, 체중, 식욕, 전반적인 건강 상태를 매일 모니터링합니다.
종양 형성은 일반적으로 1주일에서 1개월 이내에 발생합니다 . 실험 설계에 따라 종양이 1000mm³를 초과하기 전에 생쥐를 안락사시키고 사진을 촬영합니다.
참고사항: 동물 복지상의 이유로 종양 부담량이 1500 mm³를 초과하지 않도록 하세요.
7. 종양 수확
안락사 후 종양의 일부를 액체 질소에 동결하여 나중에 RNA/단백질을 추출합니다.
면역조직화학이나 면역형광 분석을 위해 남은 조직을 포르말린에 고정합니다.
주의사항 및 참고사항
I. 세포
1. 세포주 특성
종양 형성은 세포주에 따라 다릅니다. 종양 형성을 평가하기 위한 예비 연구를 수행하고 관련 문헌을 사전에 검토하십시오.
2. 세포 상태
오염을 방지하기 위해 무균술을 유지하십시오. 마이코플라스마 감염은 흔하며 세포 대사, 증식 및 형태를 변화시켜 종양 재현성에 영향을 미칩니다.
사용 전 마이코플라스마 음성 여부를 확인하십시오 . 대수기(log phase)의 세포만 사용하십시오. 주사 전, 그리고 필요에 따라 주사 후에도 세포 생존율을 확인하십시오.
세포 생존력을 유지하기 위해 얼음 위에 보관하십시오. 과도한 체외 계대는 피하십시오 (이식 전 3~5회 계대배양으로 제한).
II. 동물 모델
일반적인 면역결핍 마우스 균주로는 누드(Nude), NOD-Scid, NCG가 있습니다 . 종양 형성률은 면역결핍 정도와 마우스의 연령에 따라 다릅니다. 예비 연구 및 발표된 문헌을 바탕으로 적절한 동물 모델을 선택하는 것이 좋습니다. 나이가 들면서 면역 기능이 더욱 활성화되므로, 나이가 많은 마우스는 사용하지 마십시오. 예를 들어, 누드 마우스의 경우 NK 세포 활성도는 8주 후부터 증가하기 시작합니다. 4~6 주령 마우스는 일반적으로 선호되는 이유는 면역 체계가 미성숙하여 종양 발생률이 높기 때문입니다.
III. 주사 부위
일반적으로 사용되는 피하 주사 부위는 네 가지입니다(아래 그림 참조). 세포주의 종양원성과 실험의 구체적인 목표에 따라 주사 부위를 선택하는 것이 좋습니다. 겨드랑이 아래 부위 (3번 부위)는 혈액 공급이 풍부하고 오른쪽에서 접근이 용이하기 때문에 일반적으로 최적의 부위로 간주됩니다 . 빠르게 성장하는 종양의 경우, 하지나 등쪽 부위와 같이 혈관이 비교적 적은 부위를 이용하여 종양 진행을 늦출 수 있습니다. 또는, 주사하는 세포의 수를 줄이는 것도 종양 성장 속도를 조절하는 데 도움이 될 수 있습니다.
IV. 세포 투여량
최적의 세포 용량은 세포주, 마우스 균주, 그리고 주사 부위에 따라 달라집니다. 종양 형성에 가장 적합한 세포 농도를 결정하기 위해 다양한 용량 구배를 적용한 예비 연구를 수행하는 것이 권장됩니다.
또한, 세포 유형에 따라 보조적인 요소가 필요할 수 있습니다 . 대부분의 고형암 세포주의 경우, 세포와 마트리젤을 1:1 비율로 혼합하면 충분합니다. 난소암 모델에서는 일반적으로 에스트로겐 보충이 필요한데, 일반적으로 세포 이식 후 별도의 주사를 통해 투여합니다.
V. 동물 사육장
마우스는 운송 중 스트레스 반응을 경험할 수 있으며, 이는 다양한 병태생리학적 변화로 이어져 실험 결과에 변동성이나 오류를 초래할 수 있습니다. 따라서 도착 직후 동물을 실험에 사용해서는 안 됩니다. 실험 시작 전 1~2주간 의 적응 기간을 갖는 것이 좋습니다 .
엄격하게 관리되는 사육 환경을 유지하십시오 . 면역결핍 마우스는 SPF(특정 병원균 무함유) 차단 시설에 사육해야 하며 , 교차 오염 및 감염을 방지하기 위해 면역이 정상인 마우스와 별도의 방에 사육해야 합니다.
누드 마우스는 환경 내 약한 항원에 만성적으로 노출될 경우, NK 세포와 기타 잔류 면역 세포의 활성이 점진적으로 증가할 수 있습니다. 이는 종양 세포에 대한 비특이적 면역 반응을 증가시켜 시간이 지남에 따라 종양 발생률을 감소시킬 수 있습니다.
심각한 면역결핍을 보이는 NCG 마우스 및 관련 균주는 병원균에 매우 취약합니다. 따라서 감염 위험을 최소화하기 위해 사육 환경을 깨끗하게 유지하고 철저히 소독해야 합니다 .
자주 묻는 질문:
일반 쥐 대신 누드 쥐를 사용하는 이유는 무엇입니까?
누드 마우스는 흉선이 없고 면역 체계가 심각하게 약화되어 있습니다. 따라서 이종이식에 대한 내성이 강하고 종양 생착에 이상적입니다. 반면, 일반 마우스는 면역 체계가 온전하여 이식된 종양 세포에 대한 면역 거부 반응을 유발하여 종양 형성을 방해할 수 있습니다.
프로토콜을 올바르게 따랐음에도 불구하고 종양이 생기지 않는 이유는 무엇입니까?
가능한 이유는 다음과 같습니다.
- 세포 생존력이 낮거나 세포주의 종양 형성 가능성이 낮습니다.
- 세포주에는 이식성을 개선하기 위해 마트리젤을 추가하거나 접종량을 늘려야 할 수도 있습니다.
- 숙주 마우스는 면역학적으로 성숙되었거나 면역 결핍이 불충분하여 면역 거부 반응이 나타날 수 있습니다. 더 심각한 면역 결핍을 가진 마우스 사용을 고려하십시오.
- 종양 발달에는 시간이 걸립니다. 눈에 띄는 결절은 1주일 후에 나타날 수 있지만, 고형 종양은 1~2개월이 걸릴 수 있습니다. 지속적인 관찰이 필요합니다.
종양이 처음에는 커졌다가 나중에 줄어들거나 사라진 이유는 무엇입니까?
이는 염증 반응이나 숙주에 의한 종양 세포의 면역 제거로 인해 발생할 수 있습니다. 종양이 퇴행하여 성장이 재개되지 않으면, 면역 결핍 정도가 더 높은 마우스를 사용하는 것을 고려해 보십시오.
같은 그룹 내에서도 종양의 크기가 다양한 이유는 무엇인가?
종양 성장은 다음의 영향을 받을 수 있습니다.
- 쥐들 사이의 생물학적 변이(예: 나이, 체중, 면역 상태).
- 세포 현탁액의 양, 농도 또는 주입 기술의 차이.
- 부지 선정이나 마트리젤 사용에 일관성이 없음.
종료점 분석에 적합한 종양 크기는 무엇입니까?
동물복지 규정에 따르면 종양 무게는 쥐 체중의 10%를 초과해서는 안 되며, 어느 치수든 15mm를 초과해서는 안 됩니다.
바이오마커 발견이나 단기 연구의 경우: 150~250 mm³의 종양 부피를 목표로 합니다.
장기 약물 효능 연구의 경우: 50~150 mm³가 권장됩니다.
불규칙한 모양의 종양을 정확하게 측정하는 방법은?
종양 진행과 전반적인 건강 상태를 확인하기 위해 매일 동물을 모니터링하세요.
피하 종양은 캘리퍼스를 사용하여 측정할 수 있습니다.
내부 종양은 생체 형광 영상이나 사후 해부를 통해 평가할 수 있습니다.
종양 부피를 추정하려면 다음 공식을 사용하세요: 종양 부피 = (길이 × 너비²) / 2 .
성공률을 높이기 위해 동일한 마우스에 여러 개의 종양을 유도할 수 있나요?
아니요. 마우스 한 마리당 한 부위만 주사할 수 있습니다. 같은 숙주에 여러 종양이 있을 경우 서로 간섭하여 해석이 복잡해질 수 있습니다.
종양이 성장하는 동안 쥐에게 괴사나 궤양이 생기면 어떻게 되나요?
이는 감염이나 과도한 종양 부담을 나타낼 수 있습니다.
적절한 치료(예: 항생제)를 시작합니다.
궤양/괴사가 1.5cm를 초과하거나 48~72시간 동안 치유되지 않을 경우 인도적 안락사를 고려해야 합니다.
종양 연구가 완료된 후에는 쥐를 어떻게 다루어야 합니까?
동물 복지에 대한 기관 지침을 준수하십시오. 동물이 다음과 같은 증상을 보이는 경우 안락사를 시행해야 합니다.
- 지속적인 체중 감소
- 심한 설사 또는 비정상적인 배설
- 종양 궤양, 괴사 또는 감염
- 동물의 안녕을 위협하는 빠른 종양 성장
종양 전이를 평가하는 방법은?
- 육안적 부검 : 간, 신장 또는 기타 장기에 눈에 보이는 전이성 병변.
- 생체 내 영상 : 종양 세포에 표지(예: 루시퍼라제 또는 형광 단백질)가 있는 경우 광학 영상 시스템을 사용하여 전이를 모니터링할 수 있습니다.
- 소동물 MRI : 간이나 폐와 같은 장기의 전이를 정확하게 감지할 수 있습니다.