실험 절차
1. 마트리젤 준비
1) 실험 전날, 냉동실에서 마트리젤을 꺼내 4°C 냉장고에 하룻밤 동안 넣어 해동합니다. 그동안 사용할 모든 재료는 미리 식혀둡니다.
2) 실험하는 동안 마트리젤을 얼음 위에 두세요.
3) 혈관신생 슬라이드의 살균된 포장을 열고 슬라이드를 꺼냅니다.
4) 각 웰에 마트리젤 10 μL를 넣고, 피펫 끝이 웰 중앙 바로 위에 오도록 하여 마트리젤이 위쪽 웰로 흘러내려 잔여물이 남지 않도록 합니다.
2. 겔 형성
1) 먼저 슬라이드를 덮고, 습기가 있는 종이 타월을 깔고 10cm 배양 접시를 준비하여 습도가 높은 챔버를 만듭니다.
2) 슬라이드를 배양접시에 넣고 덮습니다.
3) 배양 접시 전체를 CO2 인큐베이터에 넣고 약 30분 동안 그대로 두어 겔이 형성되도록 합니다. 그동안 세포 현탁액을 준비합니다.
3. 세포 파종
1) 소화된 세포를 사용하여 2×10^5 세포/ml의 밀도로 세포 현탁액을 준비하고 완전히 혼합합니다.
2) 마트리젤이 굳은 슬라이드를 꺼냅니다.
3) 각 웰에 세포 현탁액 50 μL를 넣고, 피펫 끝이 아래쪽 젤에 닿지 않고 위쪽 웰 위에 수직으로 유지되도록 합니다.
4) 세포 배양 배지를 넣고 뚜껑을 덮은 후 그대로 두세요. 시간이 지나면 모든 세포가 마트리젤 표면에 가라앉을 것입니다.
4. 이미지 획득
세포의 성장 속도에 따라 세포를 관찰하고 사진을 찍어 이미지를 저장합니다.
5. 면역형광 염색 (선택 사항)
1) 겔이나 세포 네트워크를 손상시키지 않고 웰에서 배지를 조심스럽게 제거합니다. 칼세인을 무혈청 배지에 희석하여 최종 농도가 6-8 µg/mL가 되도록 합니다.
2) 세포가 완전히 잠길 정도로 염색 용액을 넣고, 어두운 곳에서 실온에서 30~40분 동안 배양합니다.
3) PBS로 3번 세척하고, 세포가 떨어지지 않도록 위쪽 웰에 PBS를 천천히 추가합니다.
4) Ex=485 nm, Em=529 nm 파장을 사용하여 형광을 관찰합니다.
6. 결과 정량화
튜브 길이, 적용 범위, 루프 수, 노드 수를 측정하고 기록한 다음 통계 분석을 수행합니다.
노트
1) Matrigel과 접촉하는 모든 팁, 플레이트 및 EP 튜브는 미리 냉각해야 합니다.
2) 마트리젤을 펴 바르는 동안 공기 방울이 생기지 않도록 주의하세요. 공기 방울은 관찰을 방해할 수 있습니다.
3) 세포가 균일하게 분포되도록 하여 응집이 일어나지 않도록 하여 균일한 관 형성에 영향을 미칠 수 있습니다.
4) 세포를 접종할 때는 젤의 평탄성을 해치지 않도록 조심스럽게 다루어 이미징에 영향을 미치지 않도록 하세요.
5) 세포 현탁액의 온도를 유지하세요. 온도가 낮으면 젤이 녹아서 접종 후 세포가 이동하여 튜브로 분화하기 어려워질 수 있습니다.