오르가노이드 실험: 꼭 알아야 할 40가지 FAQ

1. 오르가노이드는 단일 세포 유형으로 구성되어 있습니까, 아니면 다세포 구조입니까?

오가노이드는 성체 줄기세포 또는 만능줄기세포에서 체외 3차원 배양을 통해 얻은 3차원(3D) 조직 유사체입니다. 오가노이드는 단일 세포 유형으로 구성되지 않습니다. 대신, 전구체 특성을 가진 줄기세포에서 유래하며, 증식과 분화를 거쳐 자가조립을 통해 해당 생체 기관의 형태, 구조 및 기능을 모방하는 다세포 구조로 구성됩니다.

2. 오르가노이드 배양을 위한 샘플의 출처는 어디인가요?

• 성체줄기세포(ASC), 다능성줄기세포(PSC), 유도다능성줄기세포(iPSC)를 포함한 줄기세포에서 유래한 오르가노이드.
• 종양 조직에서 일반적으로 확립되는 조직 유래 오르가노이드

3. 신선한 조직이 없는 경우에도 냉동보관된 조직을 3D 배양에 사용할 수 있나요?

네, 하지만 동결보존된 조직의 크기가 매우 중요합니다. 더욱이, 1차 동결보존된 조직과 세포의 생존력이 크게 감소하여 후속 배양의 성공률이 크게 낮아집니다.

4. 오르가노이드는 어떻게 냉동보관하고 해동되나요?

오가노이드는 생존력과 분화 잠재력이 최적일 때인 2~5회 계대 배양(P2~P5)에 동결보관하는 것이 가장 좋습니다. 오가노이드의 해동은 표준 세포 회수 프로토콜을 따를 수 있습니다.

5. 배양된 오가노이드의 크기를 조절해야 할까요? 무조건 큰 것이 더 좋은가요?

네, 크기 조절이 필수적입니다. 오가노이드는 혈관 및 체액 순환 시스템이 없기 때문에 직경이 500μm 미만으로 유지되는 것이 이상적입니다. 더 큰 오가노이드에서는 확산이 제한되어 중심부 세포에 충분한 산소와 영양분이 공급되지 않아 중심부의 세포 사멸이 증가합니다.

6. 마트리젤 외에 오르가노이드 배양에 사용할 수 있는 다른 재료는 무엇입니까?

대체 기질은 다음과 같습니다.

• 세포외기질(dECM) 및 유래 단백질
• 합성 하이드로젤
• 재조합 단백질 기반 젤을 개발했습니다.

7. 유기체의 지향성 분화는 어떻게 달성될 수 있나요?

줄기세포 유래 오가노이드의 초기 발달은 여러 신호전달 경로에 의해 조절됩니다. 시험관 내에서는 분화를 유도하는 특정 성장 인자와 사이토카인을 첨가하여 이러한 경로를 모방할 수 있습니다. 예를 들어, Y27632와 Activin A는 만능줄기세포(PSC/iPSC)가 완성 내배엽(DE)으로 분화하도록 유도하고, 이어서 Wnt3a, FGF-4, 그리고 Noggin이 세포 계통 특이적 분화를 유도하도록 유도할 수 있습니다.

8. 임상 검체를 채취할 때 오염을 방지하려면 어떻게 해야 하나요?

• 가능하면 무균 채취를 실시하세요.
• 페니실린/스트렙토마이신 등 항생제를 두 배 함유한 PBS로 조직을 전처리합니다. 외부 환경에 노출된 조직(위, 장, 방광 종양 등)의 경우 3~5% 항생제를 함유한 PBS에 5~10분간 담가둡니다. 다른 조직의 경우 1~2% 항생제를 약 5분간 사용합니다.
• 세포 분리에 사용되는 모든 시약에 1% 항생제와 적절한 일차 세포 항생제를 첨가합니다.

9. 종양 조직 수집, 보존 및 운반 시 고려 사항은 무엇입니까?

종양이 풍부한 조직을 최대한 많이 채취하고, 오염 위험을 줄이기 위해 검체가 공기에 노출되는 시간을 최소화하십시오. 조직을 즉시 특수 보존 용액이 담긴 멸균 튜브에 넣고 냉장(~4°C)에서 신속하게 검사실로 운반하십시오(이상적으로는 검체 채취 후 2~4시간 이내).

10. 종양 병변에서 유래한 오가노이드와 인접한 정상 조직에서 유래한 오가노이드 사이에는 차이가 있습니까? 종양 조직 샘플링의 요건은 무엇입니까?

네, 차이가 있습니다. 종양은 본질적으로 이질적이며, 서로 다른 부위의 오가노이드는 종종 형태학적 및 기능적 차이를 보입니다. 원발성 종양 부위의 오가노이드는 일반적으로 인접한 정상 조직의 오가노이드에 비해 더 불규칙하고 침습적인 구조를 보입니다. 모델링이나 약물 스크리닝의 변동성을 최소화하려면 종양에서 여러 개의 생존 가능한 부위를 샘플링하십시오.

11. 환자 유래 유기체(PDO) 약물 감수성 검사에서 어떤 유형의 약물을 테스트할 수 있습니까? 

PDO 테스트에 적합한 항암제의 주요 범주는 다음과 같습니다.

• 세포독성 항암화학요법제(예: 파클리탁셀, 시스플라틴/카르보플라틴, 5-FU)
• 표적 치료법(예: EGFR, HER2, VEGFR을 표적으로 하는 억제제)
• 면역 치료법, 특히 면역 체크포인트 억제제(예: PD-1/PD-L1 항체).

12. PDO 배양의 성공률은 얼마입니까?

성공률은 조직 기원에 따라 약간씩 다르지만, 일반적으로 63%에서 70% 사이이며, 일부 보고에서는 최대 90%에 달하기도 합니다. 성공률은 조직 생존율에 크게 좌우됩니다. 임상적 취급 절차와 짧은 체외 실험 시간을 통해 성공률을 향상시킬 수 있습니다.

13. 냉동 조직을 오르가노이드 배양에 사용할 수 있나요?

냉동보관은 생존력 손실이 크기 때문에 일반적으로 권장되지 않습니다. 그러나 조직을 -80°C에 보관하는 경우, 오가노이드 배양의 최적 기간은 6주 이내입니다. 액체질소에 보관한 조직의 경우 더 오래 보관할 수 있지만, 최상의 결과를 위해서는 6개월 이내에 배양하는 것이 좋습니다.

14. 일차 세포 분리 과정에서 섬유아세포가 종종 발견됩니다. 어떻게 처리해야 합니까?

• 대부분의 오염된 섬유아세포를 제거하기 위해 반복적인 사전 도금을 수행하여 섬유아세포의 약한 접착력을 활용합니다.
• 시중에서 판매하는 섬유아세포 제거 키트를 사용하세요. 단, 이것이 유기체 형성에 미치는 영향은 실험적으로 검증해야 합니다.

15. 종양 오가노이드 배양에는 얼마나 많은 종양 조직이 필요합니까? 생검용 재료만으로 충분합니까?

수술 검체의 경우, 종양 조직은 완두콩 2~3개보다 커야 합니다. 코어 바늘 생검의 경우, 최소 2~3개의 생검 코어가 권장됩니다. 내시경 생검의 경우, 최소 6개의 조직 조각을 채취해야 합니다.

16. 초기 종양 조직이 작고 결과적으로 생성된 오르가노이드가 후속 검사에 충분하지 않은 경우 어떻게 해야 합니까?

계대배양 중 표현형 변동 가능성이 있으므로, 과도한 증식은 권장되지 않습니다. 문헌에서는 계대배양 횟수를 2~3세대(최대 5세대)로 제한할 것을 권장합니다. 5회 계대배양 후에도 세포 수가 충분하지 않으면, 384-웰 플레이트나 미세유체 장치와 같은 다른 검출 플랫폼을 사용하여 분석량을 줄이는 것을 고려하십시오.

17. 종양 조직에 정상 세포가 포함되어 있나요? 어떻게 제거할 수 있나요?

네, 종양 조직에는 소량의 정상 세포가 포함되어 있을 수 있습니다. 절제 시 정상 조직은 가능한 한 피하십시오. 일차 세포 분리 후, 자기 활성 세포 분류(MACS) 또는 형광 활성 세포 분류(FACS)를 사용하여 오가노이드 배양 전에 종양 세포를 농축할 수 있습니다. 소량의 정상 세포는 일반적으로 오가노이드 모델링에 큰 영향을 미치지 않으며, 허용될 수 있습니다.

18. 종양 조직에서 추출한 일차세포가 때때로 빨간색인 이유는 무엇입니까?

종양은 혈관이 풍부하기 때문에 적혈구(RBC)가 잔류하는 경우가 흔합니다. 소량의 적혈구는 오가노이드 배양에 영향을 미치지 않습니다. 적혈구 오염이 심한 경우, 배양 전에 적혈구 용해 완충액을 사용하십시오.

19. 오가노이드 배양 중 검은 입자가 발생합니다. 어떻게 제거할 수 있나요?

검은색 입자는 파편이나 세포 조각일 가능성이 높습니다. 두 가지 방법을 사용할 수 있습니다.

1. 유기체를 단일 세포로 분해한 후 배양 배지로 반복해서 세척하여 오염 물질을 희석합니다.

2. 멸균된 메스를 사용하여 유기체를 반으로 자른 다음 1mL 주사기를 사용하여 내부를 배양 배지로 조심스럽게 씻어냅니다.

20. 오가노이드의 통과 횟수에 제한이 있나요? 몇 번까지 통과할 수 있나요? 

계대 횟수는 세포 유형에 따라 달라집니다. 대부분의 오가노이드는 체외에서 최대 10회(6개월 이상)까지 계대 배양할 수 있습니다. 배양 배지 조성 또한 중요한 역할을 합니다. 조건 배지는 완전히 정의된 합성 배지보다 장기 증식을 지원하는 경우가 많습니다.

21. 종양 세포주(예: HepG2)를 환자 유래 오르가노이드(PDO)로 배양할 수 있습니까?

아니요. PDO는 이질적인 조직에서 유래한 복잡하고 자가 조직화된 3차원 구조입니다. 단일 불멸화 세포주에서 형성된 3차원 스페로이드는 PDO로 간주할 수 없으며, 3차원 스페로이드 또는 종양 스페로이드라고 합니다.

22. 오르가노이드를 통과시키는 기준은 무엇입니까?

계대는 오가노이드 발달에 따라 달라집니다. 일반적으로 오가노이드는 직경이 100~200μm에 도달하면 5~10일마다 계대 배양됩니다. 일부 성장이 느린 유형의 경우 계대 배양 가능 크기에 도달하는 데 몇 주가 걸릴 수 있습니다.

23. 생존 가능한 유기체의 수를 세는 방법은 무엇입니까?

칼세인-AM을 최종 농도 0.2 μmol/L가 되도록 배양 배지에 첨가하고 37°C에서 60분간 배양합니다. PBS로 부드럽게 세척하여 과량의 염료를 제거한 후 새로운 배지를 첨가합니다. 490 nm 여기 필터와 515 nm 방출 필터를 사용하여 형광 현미경으로 이미지를 촬영합니다. 살아있는 오가노이드는 녹색으로 뚜렷하게 보입니다. 직경이 20 μm 이상인 오가노이드를 계수합니다.

24. 유기체 생존율은 어떻게 계산되나요?

생존 가능성은 다음과 같이 계산됩니다.

X = (N_live / N_total) × 100%

어디:

X = 유기체 생존력(%)

N_live = 생존 가능한 유기체의 수

N_total = 총 유기체 수

25. 유기체를 특성화하는 데 어떤 방법을 사용합니까?

기본적인 특성 분석에는 광학 현미경 검사와 형태학적 분석을 위한 H&E 염색이 포함됩니다. 추가 검증에는 계통 특이적 바이오마커 검출을 위한 웨스턴 블롯, qRT-PCR, 면역형광, 유세포 분석이 포함됩니다. 유전체 시퀀싱은 원 조직에 대한 유전적 충실도를 평가할 수 있습니다. 기능 분석(예: 위 오가노이드의 산 분비, 심장 오가노이드의 자발적 박동)을 통해 추가적인 검증이 가능합니다.

26. 정상 세포도 오가노이드를 형성할 수 있나요? 종양 오가노이드 배양 중에 정상 오가노이드를 제거하는 방법은 무엇인가요? 

네, 정상 상피 세포도 오가노이드를 형성할 수 있습니다. 종양 오가노이드를 강화하려면 다음을 수행하세요.

• H&E 형태학에 기반한 현미경으로의 수동 채취
• 종양 기관체 성장을 촉진하기 위해 배양 배지를 변형합니다(예: 선택적 억제제를 추가합니다).
• 유기체를 단일 세포로 분리하고 종양 세포 농축을 위해 FACS 또는 MACS를 수행합니다.

27. 약물 감수성 검사를 하기 전에 PDO를 마트리젤에서 분리해야 합니까?

아니요. 3D 구조는 생체 내 반응을 재현하는 데 필수적입니다. 마트리젤을 제거하면 구조적 무결성이 손상되고 분석 정확도가 떨어집니다. 대부분의 가용성 약물은 마트리젤을 통해 확산될 수 있습니다. 그러나 면역 세포 공동 배양 또는 세포독성 분석의 경우, 마트리젤 제거가 필요할 수 있습니다.

28. PDO 모델이 동물 모델(예: PDX)을 완전히 대체할 수 있나요?

PDO는 PDX 모델을 부분적으로 대체할 수 있지만 완전히 대체할 수는 없습니다. 동물 모델은 전신 약물 대사, 종양 미세환경 상호작용, 면역 침윤 및 전이와 같은 복잡한 과정을 더 잘 재현합니다. 이러한 과정들은 시험관 내에서는 완전히 모델링되지 않습니다.

29. PDO가 비정상적인 성장(예: 주기 단축, 빠른 증식)을 보이는 경우, 그 원인은 무엇일까요?

외부 요인:

• 빠르게 성장하는 세포(예: 섬유아세포)에 의한 오염. 조직 염색을 통해 이러한 오염을 식별할 수 있습니다.
• 배양 배지 구성의 변화(예: 성장 촉진 요소의 추가).

내부 요인:

• 유전자 돌연변이. 시퀀싱을 수행하고 초기 계대배양 PDO와 비교하여 확인하세요.

30. PDO의 약물 민감도를 평가하는 방법은 무엇입니까?

일반적인 방법으로는 CCK-8, ATP 기반 생존율 분석, 그리고 생세포/사세포 염색 등이 있습니다. ATP 분석은 대사 활동과 생존 세포 수를 반영하기 때문에 가장 널리 사용됩니다. IC50(반치 최대 저해 농도) 값은 분석 소프트웨어를 사용하여 계산하여 가장 효과적인 약물을 식별합니다.

31. 약물 감수성 검사에서 PDO와 원발성 종양 세포의 약물 농도 범위가 동일합니까?

아니요. PDO의 유효 약물 농도는 일반적으로 2D 일차 세포보다 높습니다. 정식 약물 검사 전에 사전 실험(용량 결정 분석)을 수행하는 것이 좋습니다.

32. 어떤 단계에서 오르가노이드가 약물 테스트에 적합합니까?

약물 검사는 유전적 안정성과 생물학적 활동이 가장 높은 5회 통과 이내의 오르가노이드를 사용하여 수행하는 것이 가장 좋습니다.

33. 성공적인 오르가노이드 구축을 정의하는 것은 무엇입니까?

• 초기 형태학적 변화: 낭포성, 출아성, 밀집성 또는 느슨한 구조 형성.
• 면역염색을 통해 확인된 혈통 특이적 바이오마커의 발현은 원래 조직의 분포와 일치합니다.
• 추가적으로 시퀀싱을 통해 원본 조직과의 유전적 유사성을 평가하여 검증합니다.

34. 오르가노이드 배양과 기존 2D 세포 배양의 주요 차이점은 무엇입니까?

(1) 배양 방법: 유기체는 구조를 유지하기 위해 3D 스캐폴드(예: Matrigel)가 필요하지만 2D 배양은 평평한 표면에서 자랍니다.

(2) 분화 및 복잡성: 유기체는 시험관 내에서 분화 및 자가 조직화를 거치며 여러 성장 인자가 포함된 복잡한 배지가 필요합니다. 2D 배양에는 일반적으로 단일 세포 유형과 더 간단한 배지가 포함됩니다.

(3) 세포 출처: 오르가노이드는 다능성 상피줄기세포에서 유래합니다. 2D 배양은 불멸화된 세포주를 포함한 다양한 세포 유형을 사용할 수 있습니다.

35. 3차원 구조가 표적 조직과 일치하는 진짜 유기체인지 확인하는 방법은 무엇입니까?

다중 모드 검증(H&E 염색, 면역조직화학(IHC), 단일세포 RNA 시퀀싱)을 사용하십시오. 종양 오가노이드의 경우, 알려진 바이오마커의 발현을 평가하십시오. 다음은 NCCN 가이드라인 및 문헌에 기반한 대표적인 마커입니다.

오르가노이드 유형	주요 바이오마커
위암	p53, CEACAM1, KRT20, E-카데린, KRT7, Ki67
유방암	ER-α, Her2, E-카드헤린, KRT5, KRT14, PR, p63, 사이토케라틴 8, P-카드헤린, KRT18, Ki67
비인두암	Ki67, CD133, CD44
난소암	p53, Her2, PAX8, ER-α, PR, KRT7, E-Cadherin, CD9, KRT19, EpCAM, ALDH1A1, CD44, 사이토케라틴 8, KRT20, Ki67, HE4
대장암	Ki67, MSH6, CDX2, KRT20, β-카테닌, P-CK, OLFM4
췌장암	Ki67, 시냅토피신, KRT19, 크로모그라닌 A, MUC1
폐암	p63, 냅신 A, KRT7, NCAM, 시냅토파이신
간암	Ki67, EpCAM, α-태아단백질, GPC3, β-카테닌, KRT19

36. 문헌에 설명된 것과 내 유기체의 형태가 다를 수 있는 이유는 무엇일까요?

다음과 같은 이유로 변형이 발생할 수 있습니다.

• 환자 간 이질성 및 종양 하위 유형
• 성장 인자 품질이나 배치의 차이
• 문화 조건.

HE, IHC, 그리고 원본 조직에 대한 시퀀싱을 사용하여 오가노이드의 동일성을 검증하는 것이 좋습니다. 형태학적 특징은 검사실마다 다를 수 있으며, 공개된 이미지에만 국한되어서는 안 됩니다.

37. 오가노이드 약물 분석에서 DMSO가 용매로 사용됩니다. 농도를 조절해야 합니까?

네. 세포독성 효과를 피하기 위해 최종 DMSO 농도는 일반적으로 0.5%(v/v) 이하로 유지해야 합니다.

38. 마트리젤에서 오르가노이드를 회수하는 방법은 무엇입니까?

권장사항: 세포나 표면 단백질을 손상시키지 않고 마트리젤을 부드럽게 분리하는 상업용 오르가노이드 회수 솔루션을 사용하세요.

대안: 샘플을 얼음 위에 식혀서 마트리젤을 액화시킨 다음, 조심스럽게 피펫으로 옮겨 오르가노이드를 분리합니다.

39. 오가노이드 회수 과정에서 많은 오가노이드가 튜브 벽에 달라붙습니다. 회수 효율을 높이는 방법은 무엇일까요? 

수집 후, 원심분리기에서 스윙 버킷(수평) 로터를 사용하십시오. 오가노이드를 효과적으로 펠렛화하고 세포벽 부착을 최소화하기 위해 원심분리력을 약간 높이십시오(예: ~300 × g, ~1000–1200 rpm).