mRNA 기술에서 캡 구조의 진화와 중요성

Cap 구조는 mRNA 백신 및 치료제 개발에 필수적인 요소입니다. 합성 mRNA 기술은 Cap1을 이용하여 안정성과 번역 효율을 향상시키고, 톨유사수용체(TLR) 및 기타 면역 센서에 의한 mRNA의 선천 면역 인식을 감소시켜 원치 않는 면역 활성화를 최소화합니다. 이를 통해 원치 않는 염증 반응을 방지하고, 인간 세포에서 치료용 mRNA의 안정성과 효능을 향상시킵니다.

초기 발견 및 Cap0 구조

1970년대 중반, 진핵생물 mRNA 연구에서 현재 Cap0로 알려진 5' 말단 구조가 발견되었습니다. 이 구조의 5' 말단 첫 번째 뉴클레오타이드에 N7-메틸구아노신 캡(m7G)이 결합되어 있습니다. 이러한 변형은 mRNA가 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호되고, 핵 외수송을 보조하며, 번역 개시를 위한 리보솜 인식을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다. Cap0는 최초로 규명된 캡 구조였으며, 메틸화는 구아노신 캡 자체에만 국한되었습니다. 이 5' 캡과 그 기능의 발견은 진핵생물 mRNA 캡과 mRNA 변형에서의 캡의 역할을 이해하는 데 중요한 돌파구를 마련했습니다.

Cap0 구조

Cap1의 등장

진핵생물 mRNA의 핵심 특징인 Cap1 구조는 mRNA 안정성, 번역 및 면역 인식에 중추적인 역할을 합니다. 5'-5' 삼인산 결합을 통해 첫 번째 뉴클레오타이드에 연결된 N7-메틸구아노신(m7G)으로 구성된 mRNA 캡 구조는 1970년대 진핵생물 mRNA 전사 후 변형에 대한 초기 연구에서 발전했습니다.

Cap1 구조

5'-말단 캡 mRNA의 구조.【1】 추가 연구를 통해 대부분의 진핵생물 mRNA에서 캡(+1 위치) 다음의 첫 번째 뉴클레오타이드도 리보스의 2'-O 위치에서 메틸화되는 것으로 밝혀졌습니다. 이 과정을 2'-O-메틸화라고 합니다. Cap1 구조(m7GpppNm)로 알려진 이 발견은 mRNA 변형에 또 다른 기능적 중요성을 더했습니다. Cap1 변형은 mRNA 안정성을 미세하게 조정하고 특히 포유류 세포에서 선천 면역 체계의 면역 인식을 방지하는 것으로 밝혀졌으며, RIG-I, TLR, MDA5와 같은 패턴 인식 수용체의 인식을 회피하는 데 도움이 됩니다.【2】 이는 mRNA 대사와 mRNA 백신 접종 및 유전자 치료 응용 분야를 포함한 mRNA 기반 기술의 발전에 매우 중요했습니다.

mRNA 산업의 기술적 과제와 현재 솔루션

mRNA 백신의 광범위한 적용 및 최적화에는 고용량 mRNA, 면역 반응, 안정성 및 전달 문제를 포함한 여러 기술적 과제가 남아 있습니다. mRNA 산업의 중요한 과제 중 하나는 강력한 면역 반응을 유도하기 위해 고용량 mRNA가 필요하다는 것입니다. 이는 다음과 같은 여러 요인 때문입니다.

빠른 분해: mRNA는 본질적으로 불안정하며 생물학적 시스템에 존재하는 디캡핑 효소와 리보뉴클레아제(RNase)에 의해 분해되기 쉽습니다.

제한된 번역 효율: mRNA가 단백질로 번역되는 효율은 다양할 수 있으며, 면역 반응에 필요한 충분한 항원 수준을 생성하기 위해서는 더 많은 양의 mRNA가 필요합니다. 번역 효율은 Cap1과 번역 개시 인자 eIF4E의 친화도와 관련이 있습니다.

번역 개시 복합체

진핵생물에서 기본 번역 개시 복합체의 형성.【3】

면역원성 및 원치 않는 면역 반응: 세 번째로 큰 장애물은 mRNA 자체, 특히 dsRNA 또는 불완전 mRNA에 의해 유발될 수 있는 선천 면역 반응입니다. 적응 면역 체계를 자극하기 위해서는 일정 수준의 면역 활성화가 필요하지만, 과도한 활성화는 염증 반응을 유발하여 백신의 효과를 감소시키거나 부작용을 유발할 수 있습니다.

캡핑 기술 역사

효소 캡핑 기술: mRNA 연구 초기에 도입된 효소 캡핑은 구아닐릴트랜스퍼라제 및 메틸트랜스퍼라제와 같은 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 천연 5' 캡을 추가하는 기술입니다. 이 방법은 특히 치료적 응용 분야에서 mRNA 번역의 높은 정확도와 캡핑 효율을 보장합니다.
합성 캡 유사체(1980년대~2000년대): 연구자들은 캡이 있는 mRNA의 시험관 내 합성을 위해 합성 캡 유사체를 개발하여 mRNA 기능 및 유전자 발현 연구에 도움을 주었습니다. 역전 캡 유사체(ARCA)는 mRNA 합성 중 잘못된 캡 결합을 방지하여 백신 및 유전자 치료용 mRNA의 번역 효율을 향상시키도록 설계된 합성 캡 유사체입니다. 그러나 ARCA 캡핑의 캡핑 효율과 수율은 낮은 편입니다.
Cap1 기술(2010년대): mRNA 합성 과정에서 캡을 직접 결합시켜 공정을 간소화하는 Cap1 공동 전사 캡핑 방법입니다. 이 방법은 효율을 높이고 정확하게 캡핑된 mRNA의 높은 비율을 생성하므로 mRNA 백신과 같은 대규모 치료 분야에 이상적입니다.

현재 효소 캡핑 기술은 COVID-19 백신을 포함한 mRNA 기반 치료법 개발에 중요한 역할을 하며, 치료용 mRNA의 안정성과 효과적인 번역을 보장합니다.

효소 캡핑, 차세대 LZCap 캡핑, 1세대 캡핑(ARCA) 방식 비교

차세대 캡 아날로그 개발

본 연구에서는 디캡핑 효소에 대한 저항성, eIF4E에 대한 높은 친화도를 통해 번역 효율을 향상시키고 면역원성을 낮추는 캡 유사체를 개발하고자 했습니다. 이러한 발전은 항암 치료 및 유전자 치료 분야를 포함한 mRNA 기반 치료법의 효과 향상에 매우 중요합니다.

LZCap 설계

LZCap을 설계할 때, 저희는 eIF4E에 대한 높은 친화도를 가진 캡 유사체를 만드는 데 주로 집중했습니다. 효소는 기질을 비교적 "특이적으로" 인식합니다. 따라서 새로운 캡 구조를 설계할 때, 자연/기존 구조와 최대한 유사성을 유지하려고 노력합니다. 자연 구조는 리보스 3'-OH를 가지고 있으며, 이는 변형될 수 있습니다(예: 메틸화). 이러한 점을 고려하여, 저희는 3' 위치에 탄소를 추가하여 새로운 구조를 만들고, OH의 수소 결합을 모방하기 위해 NH를 추가한 후, NH의 염기성을 감소시키고 수소 결합 능력을 향상시키기 위해 아세틸기를 추가했습니다. LZCap의 활성은 메틸화된 자연 캡보다 우수한데, 이는 수소 결합 증가 때문일 수 있습니다. 메틸기 및 메톡시기와 비교하여, 아세틸 아미노기는 기질(캡)과 개시 인자(효소) 사이의 반데르발스 상호작용을 증가시킬 수도 있습니다.

아세틸 아미노기의 안정성

아세틸 아미노기는 이미 충분히 안정적입니다. 캡의 가장 불안정한 부분인 7-메틸화 위치와 포스포디에스테르 결합보다 훨씬 더 안정적입니다.

LZCap의 수율 및 캡핑 효율

LZCap AG(3'Acm) 캡을 사용하면 루시퍼라제 mRNA 캡핑 효율이 약 97.59%이며, T7 RNA 중합효소를 이용한 표준 시험관 내 전사(IVT) 반응에서 1 μg DNA 주형으로 최대 200 μg의 캡핑된 mRNA를 얻을 수 있습니다. 간단한 LiCl 침전 후 mRNA 순도는 최대 99%에 달합니다. 이처럼 높은 캡핑 효율과 수율은 LZCap을 단백질 생산 및 유전자 치료를 포함한 다양한 응용 분야에 매력적인 옵션으로 만들어줍니다.

제품	캡 AG (3'- O Me-7mG)	LZ캡 AG(3'Acm)	AG (캡핑 없음)
mRNA 수율 (μg)	164	173	200

RNAse H 기반 방법을 사용하여 LZCapped Luciferase mRNA의 캡핑 효율을 MS 분석했습니다. 캡핑 효율은 약 97.59%입니다.

디캡핑 효소에 대한 mRNA 안정성은 어떻습니까?

LZCap AG(3'Acm)와 LZCap AG M6(3'Acm)을 갖는 mRNA는 디캡핑 효소(NEB)에 대해 더 높은 저항성을 보입니다. CapM6(3'-OMe-6mA-7mG) 또한 디캡핑 효소에 저항성을 나타내지만, 일반 Cap AG(3'-OMe-7mG)는 저항성을 나타내지 않습니다.

LZCap과 eIF4E의 결합 친화력은 어떻습니까?

LZCap AG(3'Acm) 캡 mRNA의 단백질 발현은 어떻습니까?

LZCap AG(3'Acm) 캡핑 루시퍼라제 mRNA의 발현은 다양한 세포주(3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T 및 Huh7)에서 Cap1 유사체(3'-OMe-7mG) 캡핑 mRNA보다 유의하게 높았습니다. 130회 반복 실험 결과, LZCap AG(3'Acm) 캡핑 루시퍼라제 mRNA의 발현은 (3'-OMe-7mG) 캡핑 mRNA보다 평균 약 1.5배 높았습니다. 마우스에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. 단백질 발현 수준은 mRNA 서열에 따라 약간씩 다를 수 있습니다.

동물에 대한 데이터가 더 있나요?

LZCap AG(3'Acm) 또는 LZCap AG(3'FMom) 캡의 발현 효율

GLuc를 인코딩하는 mRNA는 Cynomolgus Monkey와 Pig에서 CapAG(3'-OMe-7mG) 캡 mRNA에 비해 더 높은 생체 내 발현을 보입니다.

LZCap AG 캡핑 mRNA의 선천적 면역원성은 어떠한가?

LZCapAG(3'Acm) 캡 mRNA는 낮은 선천 면역원성을 보입니다. TLR8, TLR7, IL-1A 및 B는 캡이 없는 RNA에 의해 유도되는 면역 반응에서 중요한 역할을 합니다. LZCap mRNA 면역원성 분석에 대한 생체 내 연구에서 캡이 없는 RNA는 마우스에서 면역 관련 인자의 전사 수준에 유의미한 변화를 유발하는 것으로 나타났습니다. LZCap 및 3'-OMe-7mG 캡 mRNA는 단일 RNA 자극 후 마우스에서 유사하게 낮은 면역 인자 전사 수준을 보였습니다.

안전 테스트를 해보셨나요?

네, 세포독성 시험, 인간 중합효소 억제 연구, 에임스 시험을 실시했습니다.

293T, Huh7, MRC5, THP1 및 U87MG 세포에서 3'-Acm-7mG(CC50>10000nM)의 뉴클레오시드 단량체에 대한 세포독성은 관찰되지 않았거나 거의 나타나지 않았습니다.
인간 DNA 중합효소(α,β,γ 및 Klenow)와 미토콘드리아 RNA 중합효소(hPOLRMT) 활동 억제 연구는 3'-Acm-7mG TP가 인간 DNA 또는 RNA 중합효소를 억제하지 않는다는 것을 보여줍니다.
박테리아 역돌연변이 검사(Ames)는 대부분의 설치류와 인간에서 관련 유전자 변형과 유전독성 발암물질을 검출합니다. Ames 검사 결과, 3'-Acm-7mG는 유전독성이 없는 것으로 나타났습니다.

이 제품은 특허를 받았나요?

네. 미국에서 특허를 받았습니다.

주문 정보

제품명	명세서	카탈로그 번호
LZCap AG(3'Acm)(100 mM)	100μL, 1mL	10684ES
LZCap AU(3'Acm) （ 100 mM ）	100μL, 1mL	10685ES
LZCap GG(3'Acm)(100 mM)	100μL, 1mL	10686ES
LZCap AG(3'Ma-Cy5)( 25 mM)	100μL, 1mL	10688ES
LZCap AG(3'Ma-Cy7) ( 25mM )	100μL, 1mL	10689ES
LZCap(AG(3'Ma-Cy3)(25 mM)	100μL, 1mL	문의
LZCap(AG(3'Ma-비오틴)(25 mM)	100μL, 1mL	문의
LZCap(AG(3'Ma-Peg5-FAM)(25 mM)	100μL, 1mL	문의
LZCap(AG(3'Ma-C6-MANT)(25 mM)	100μL, 1mL	문의
LZCap (AG(3'Acm) 반딧불이 luc mRNA (1μg/μL)	100μL, 1mL	문의
LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL)	100μL, 1mL	문의
LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL)	100μL, 1mL	문의
LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL)	100μL, 1mL	문의
LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL)	100μL, 1mL	문의
LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL)	100μL, 1mL	문의

참조:

코로나바이러스 RNA 캡핑 및 메틸화의 분자 메커니즘, Virologica Sinica 31(1)

mRNA 백신 - 백신학의 새로운 시대. Nat. Rev. Drug. Discov. 17, 261–279 (2018).
포유류에서 RNA 결합 단백질에 의해 조절되는 번역 개시: 트랜스 작용 인자에 의한 번역 개시 복합체의 조절, 세포 2021, 10(7), 1711

확장된 독서

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