용융 곡선이 왜 그렇게 이상해 보일까요?

qPCR에서 비정상적인 용융 곡선 문제 해결

qPCR 실험에서 용융 곡선은 제품 특이성과 데이터 정확성을 보장하는 데 필수적입니다. 비정상적인 용융 곡선은 다양한 잠재적 문제를 나타낼 수 있습니다. 이러한 불규칙성은 무엇을 나타내며, 데이터 해석에 어떤 영향을 미칠까요? 이 가이드에서는 비정상적인 용융 곡선의 일반적인 원인을 살펴보고, 깨끗하고 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 데 도움이 되는 실용적인 솔루션을 제시합니다.

1. 단일 피크이지만 날카롭지 않음

• 가능한 원인:

시약 구성이나 기기 감도 와 관련이 있습니다 .

고감도 장비를 사용 하면 더 넓은 피크가 생성될 수 있습니다( 빨간색 곡선 참조 ).

• 허용 범위:

상승에서 하강까지의 온도 범위 가 ≤ 7°C 이면 결과는 여전히 사용 가능합니다.

• 다른 가능성:

비슷한 크기의 소규모 비특정 제품 .

고농도 아가로스 겔 전기영동(예: 3%) 으로 확인합니다 .

2. 단일 피크, 그러나 Tm < 80°C

• 가능한 원인:

프라이머 다이머 만 있고 실제 제품은 없음 → 프라이머를 재설계하세요 .

제품이 <100 bp 인 경우 낮은 Tm이 예상됩니다 .

3. 이중 피크, 마이너 피크 < 80°C

• 가능한 원인:

프라이머 다이머 → 프라이머 농도를 낮추거나 재설계하세요.

짧은 비특이적 생성물 → 어닐링 온도를 높이고 온도 구배를 이용하여 최적화하세요. 일반적으로 어닐링 온도는 63°C를 초과해서는 안 됩니다. 또한, 템플릿 농도를 높여 보세요.

4. 더블 피크, 마이너 피크 > 80°C

• 가능한 원인:

비특이적 증폭

• 해결책:

어닐링 온도를 높이세요

게놈 DNA 오염 제거

5. 불규칙하거나 시끄러운 피크

• 가능한 원인:

오염된 템플릿 → 템플릿의 품질을 확인하고 필요한 경우 새 템플릿을 준비합니다.

계측기가 교정되지 않았습니다 → 정기적인 유지관리를 실시하세요.

호환되지 않는 소모품 → 호환되는 소모품에 대한 장비의 요구 사항을 확인하고 광학적 투명도가 좋은 소모품을 선택하세요.

6. 동일한 제품, 다른 Tm, 다른 시약

• 가능한 원인:

용액의 이온 강도, pH, 그리고 완충액 성분은 모두 DNA의 녹는점(Tm)에 영향을 미칠 수 있습니다. 완충액 환경은 DNA 분자의 전하 상태와 안정성에 영향을 미쳐 이중 가닥 DNA의 녹는점 변화를 초래합니다. 예를 들어, 높은 이온 강도와 산성 조건은 녹는점을 낮추는 경향이 있는 반면, 알칼리성 조건은 녹는점을 높일 수 있습니다. 따라서 시약 간 변성제의 조성이나 농도의 차이는 Tm 값의 변화를 유발할 수 있습니다.

7. 용융 곡선이 감지되지 않음

• 가능한 원인:

qPCR 설정에서 용융 곡선 획득 기능이 비활성화되었을 수 있습니다. 용융 단계에서 형광 신호 획득 기능이 활성화되었는지 확인하세요.

• 팁 :

대부분의 기기에서 형광 신호 수집은 '카메라' 아이콘을 선택하여 시작됩니다. (로슈 기기의 경우, 용융 곡선 설정의 마지막 95°C 단계에서 수집 모드를 '없음'이 아닌 '연속'으로 설정해야 합니다.)

8. 곡선 시작 시 기준선 드리프트

• 가능한 원인: ROX 농도가 계측기와 일치하지 않습니다.
• 해결 방법: ROX 보정을 비활성화 하고 곡선을 다시 확인하세요.

9. 용융 곡선이 지연되거나 불완전하게 나타납니다.

• 가능한 원인: 용융 프로그램의 최종 온도가 앰플리콘의 Tm에 도달하지 못했습니다.
• 해결책: 대상의 GC 함량이 높거나 조각 길이가 긴 경우(Tm이 90°C에 가까움), 향후 실행에서 용융 곡선 단계의 최종 온도 설정을 높입니다.

10. 곡선 시작 부분의 딥 또는 밸리

• 가능한 원인: 변성 첨가제의 농도가 높으면 어닐링/신장이 억제될 수 있습니다.
• 해결책: 형광 수집 초기 단계(60°C, 1분) 동안 일부 가닥은 여전히 ​​어닐링 중일 수 있으며, 이는 SYBR Green 신호를 증가시킵니다. 완전히 어닐링된 후 형광 피크가 나타나고, 온도와 산도가 증가함에 따라 신호 강도가 감소하여 곡선이 움푹 들어간 모양(curve dip)을 형성합니다.
• 참고: 이 효과는 무해하며 결과에 영향을 미치지 않습니다.

11. 커브 시작 지점의 약간의 경사

• 가능한 원인:

용융 곡선은 온도 증가에 따른 형광 신호의 변화를 반영합니다. 곡선 초기 단계의 변동은 형광 감소 속도의 불일치 때문입니다. 낮은 온도에서는 형광 신호가 크게 감소하지 않습니다. 이는 DNA 변성이 아직 시작되지 않았음을 나타낼 수 있습니다. 오히려, 신호의 미세한 감소는 온도에 따른 용액 pH 변화 때문일 수 있습니다. 곡선 후반부는 DNA 용융과 관련된 정상적인 형광 감소를 나타냅니다.

• 참고: 이는 최종 결과에 영향을 미치지 않습니다.

12. 동일한 프라이머 쌍은 1~2°C의 차이가 있는 다양한 샘플 웰에서 일관되지 않은 Tm 값을 생성하지만 모두 좁고 단일한 피크를 보여줍니다.

• 가능한 원인:

동일한 유전자라 하더라도 샘플에 따라, 특히 종에 따라 개별 염기에서 약간의 서열 차이가 나타날 수 있습니다. Tm은 염기 구성의 영향을 받기 때문에, 작은 차이도 녹는점에 미세한 차이를 초래할 수 있습니다.

•  참고사항 : 곡선이 좁은 단일 피크이고 Tm 차이가 2°C 이내이면 결과는 허용 가능합니다.

13. 이전에 동일한 프라이머 쌍은 이중 피크를 보이지 않았지만(왼쪽 패널) 템플릿/시약을 변경한 후에는 이중 피크가 나타났습니다(오른쪽 패널).

• 가능한 원인:

Tm <80°C의 이전 단일 피크는 프라이머 다이머만 증폭되었음을 나타냅니다(진정한 생성물 없음).
템플릿이나 시약을 바꾼 후에 이중 피크가 나타나는 것은 초기 프라이머 설계에 문제가 있음을 나타냅니다.

• 참고사항 : 프라이머를 재설계하는 것을 고려하세요.

이러한 용융 곡선의 불규칙성을 이해하고 해결함으로써 qPCR 결과의 신뢰성을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 가이드가 효과적인 문제 해결과 워크플로 최적화를 통해 더 우수하고 일관된 데이터를 얻는 데 도움이 되기를 바랍니다.