완벽한 증폭 곡선은 예측 가능한 패턴을 따르지만, 이상 현상은 온갖 이상한 모양으로 나타날 수 있습니다. 특히 ABI 계측기 에서 흔히 발생하는 문제 중 하나는 급격한 상승 곡선입니다 . 그 이유는 무엇일까요? 바로 ROX 선택 오류입니다. 그렇다면 ROX는 무엇이고 , 어떤 역할을 하며, 왜 이러한 곡선 불규칙성을 유발하고, 어떻게 해결할 수 있을까요? 자세히 살펴보겠습니다!
ROX란 무엇인가요?
1990년대 Applied Biosystems 에서 출시한 ROX™ 염료 는 실시간 PCR(qPCR) 에 사용되는 리포터 염료의 형광을 방해하지 않는 독립적인 비활성 염료입니다 . qPCR 실험 중 피펫팅 오류 , 증발 , 응축 또는 기포 와 같은 요인은 형광 신호를 왜곡하여 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. ROX™는 증발 , 피펫팅 부정확성 또는 물방울 존재 와 같은 문제를 진단하여 도움을 줍니다 . 또한 기포 로 인한 비정상적인 신호를 정상화하지만, 데이터 품질 저하나 피펫팅 오류를 수정할 수는 없습니다 .
그림 1. ROX™ 염료 정규화를 사용하지 않은 Bio‑Rad CFX384™ 시스템과 Life Technologies ViiA™7 시스템의 qPCR 증폭의 동적 범위 비교
그림 2. Rox™ 염료 정규화를 사용한 Life TechnelogiesViiA™ 7 시스템의 동적 범위
- ROX 보정 전：STD=0.028
- ROX 보정 후：STD=0.01
일부 기기에는 ROX 보정이 필요하고 다른 기기에는 필요하지 않은 이유는 무엇일까요?
모든 것은 장비의 광학 시스템 에 따라 달라집니다 . 예를 들어, Bio-Rad 장비는 모든 웰에 균일하게 빛을 비추는 균일한 광원을 사용하여 웰 간 광학 경로 차이를 제거합니다 . 이 경우, SYBR Green 신호는 PCR 산물의 형광을 직접 반사합니다(그림 A 참조). 반면, ABI 장비는 웰마다 광원이 달라 광학 경로 차이가 발생하기 때문에 일반적으로 ROX 보정이 필요합니다 . ROX 정규화는 이러한 차이를 조정하여 정확한 Rn 값을 제공합니다 (그림 B 참조).
높은 ROX vs. 낮은 ROX
높은 ROX가 필요한 장비는 청색 광원을 사용하는데 , 이는 SYBR Green을 강하게 자극 하지만 ROX는 약하게 자극합니다 . 즉, 적절한 보정을 위해서는 더 높은 ROX 농도가 필요합니다. 반면, 낮은 ROX 장비는 청색광과 백색광을 혼합하여 사용합니다. 청색광은 SYBR Green을 자극하고 백색광은 ROX를 자극하여 낮은 ROX 농도에서도 효과적으로 작동합니다.
잘못된 ROX를 선택하면 어떻게 되나요?
이미 실험을 실행했는데 비정상적인 데이터가 발견되더라도 당황하지 마세요! 플레이트 설정 에서 ROX를 " 없음 "으로 전환하고 데이터를 다시 분석하면 정상적인 증폭 곡선을 얻을 수 있습니다 . 실험 전에 불일치를 발견하면(예: qPCR 혼합물이 기기와 맞지 않는 경우) 시약 공급업체 기술 지원팀에 연락하여 교체를 요청하세요. 더욱 좋은 점은 최신 qPCR 시약 에는 대부분의 기기 모델 에 맞게 설계된 " 범용 ROX "가 포함되어 있어 여러 대의 기기를 사용하는 실험실 의 작업이 훨씬 편리해진다는 것입니다.