qPCR 프라이머는 인트론을 포함해야 합니까?

qPCR 프라이머는 인트론까지 포괄해야 할까요? 먼저 결론을 말씀드리겠습니다.
RNA 추출(예: DNase I 사용)이나 역전사 과정에서 게놈 DNA(gDNA)가 제거되고 RNA만 남는 경우, 인트론을 넘나들지 않는 프라이머를 설계해도 일반적으로 큰 영향을 미치지 않습니다.
그러나 RNA 추출 과정에서 gDNA를 제거 하지 않으면 , 최종 RNA 샘플에 잔류 게놈 DNA가 남게 됩니다. 이러한 경우, 프라이머가 인트론을 모두 포괄하지 못하면 프라이머가 cDNA뿐만 아니라 DNA 단편도 증폭시켜 mRNA 발현량을 의도치 않게 증가시킬 수 있습니다 .

인트론을 스패닝하는 것이 DNA 증폭을 피하는 데 도움이 되는 이유는 무엇입니까?

이를 이해하려면 먼저 DNA와 mRNA의 구조적 차이점을 알아야 합니다. 아래 그림에서 볼 수 있듯이, 잔류 DNA가 존재할 경우, 인트론을 포함하는 프라이머는 유전체 DNA의 큰 인트론 서열로 분리된 영역에 결합합니다.
qPCR 효소(일반적으로 500bp 미만의 단편을 증폭)의 특성으로 인해, 인트론을 가진 긴 유전체 주형은 증폭될 가능성이 낮습니다. 반면, 인트론이 없는 mRNA는 표적 단편의 효율적인 증폭을 가능하게 합니다.

 그림 1: mRNA로 전사된 DNA의 개략도

 프라이머 설계 중 유전체 DNA 증폭을 방지하려면 먼저 유전자 구조를 검토하고 충분히 긴 인트론을 선택하십시오. 그런 다음, 이 인트론에 인접한 엑손에 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하십시오.

실시간 PCR에서 원하는 앰플리콘은 일반적으로 짧고(100~300bp), PCR 조건은 짧은 단편에 맞게 최적화됩니다. 500bp를 초과하는 단편은 증폭하기 어렵습니다. 프라이머 사이의 인트론이 길면 게놈 DNA 증폭이 효율적이지 않거나 전혀 실패합니다.

 그림 2: 인트론을 가로지르는 프라이머는 게놈 DNA 증폭을 방지합니다.

인트론이 짧으면 어떻게 되나요?

인트론이 짧은 경우, 엑손-엑손 접합부 에 프라이머 하나를 설계하여 인트론 스플라이스 부위를 통과하도록 할 수 있습니다. 이렇게 하면 게놈 DNA 증폭도 방지할 수 있습니다.
하지만 이 방법은 다음과 같은 경우에는 적합하지 않습니다 .

단일 엑손만 있는 유전자

인트론이 없는 생물

게놈에 주석이 없는 종

 그림 3: 짧은 인트론을 위한 프라이머 디자인 전략

 프라이머 디자인 도구

시퀀스 입력을 통한 설계: https://www.primer3plus.com/

유전자 이름을 사용한 디자인: https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

 프라이머 설계를 위한 주요 고려 사항

최적 프라이머 길이: 18~30개 뉴클레오티드

이상 용융 온도(Tm): 65°C ~ 75°C , 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 사이의 Tm 차이는 ≤ 5°C

Tm이 너무 낮으면 GC 함량을 늘리 거나 프라이머 길이를 약간 늘려 보세요.

목표 GC 함량: 40–60%; 프라이머는 결합을 강화하기 위해 이상적으로 3' 끝에서 C 또는 G 로 끝나야 합니다.

제한 부위 앞 5' 끝에 3~4개의 추가 뉴클레오티드를 추가하여 효소 효율성을 향상시킵니다.

2차 구조가 있는 영역을 피하고 AT가 풍부한 영역과 GC가 풍부한 영역의 균형 잡힌 분포를 목표로 합니다.

피하다:

• 4개 이상의 동일한 뉴클레오티드 또는 디뉴클레오티드 반복 ( 예: ACCCC 또는 ATATATAT)
• 프라이머 내 자기 상보성 (3개 이상의 염기)
• 전방 프라이머와 역방 프라이머 간의 상보성
  이러한 문제로 인해 프라이머 다이머 또는 자체 어닐링이 발생하여 특이성이 감소할 수 있습니다.

클로닝 의 경우 최소 정제 기준 으로 컬럼 정제가 권장됩니다.

돌연변이를 위해 프라이머 중앙 쪽에 불일치 염기를 배치합니다.

Invitrogen TOPO 클로닝에 사용되는 PCR 프라이머 의 경우 프라이머를 인산화하지 마십시오 .

제품 개요