리소자임
리소자임은 무라미다제 또는 N-아세틸무라마이드 글리카노하이드롤라제라고도 불리며, 박테리아의 점액다당류를 가수분해할 수 있는 알칼리성 효소입니다.
리소자임의 작용기전
리소자임은 주로 세포벽의 N-아세틸무라민산과 N-아세틸글루코사민 사이의 β-1,4 글리코시드 결합을 파괴하여 세포벽의 불용성 점액다당류를 가용성 당펩티드로 분해하고, 이로 인해 세포벽이 파열되고 내용물이 유출되어 세균이 용해됩니다.
리소자임의 공급원
이 효소는 인체의 다양한 조직, 조류와 가금류의 난백, 눈물, 침, 혈장, 젖 및 기타 포유류 체액, 그리고 미생물에 널리 존재하며, 그중에서도 난백에 가장 많이 함유되어 있습니다. 다양한 출처에 따르면, 식물성 리소자임, 동물성 리소자임, 미생물성 리소자임, 그리고 난백성 리소자임의 네 가지 범주로 나눌 수 있습니다.
그림 1: 리소자임의 단백질 구조
리소자임의 발견 과정
|
사람 |
시간 |
기부금 |
|
찰스 니콜 |
1907 |
최초로 세균 용해 현상을 보고하고 세포벽 분해 가설을 제시 |
|
라셴코 |
1909 |
달걀흰자의 항균효과는 효소에서 나온다는 사실을 발견했습니다. |
|
알렉산더 플레밍 |
1922 |
리소자임을 발견하고 명명하였으며, 그 광범위한 존재와 항균 작용 기전을 확인하였다. |
|
로버트 로빈슨 |
1937 |
리소자임의 초기 정제 달성 |
|
데이비드 필립스 |
1965 |
리소자임의 구조를 분석하고 촉매작용 기전을 밝혀 효소학과 단백질화학의 발전을 촉진했다. |
리소자임 생산 공정
1. 계란 흰자에서 라이소자임을 추출하기 위한 클래식 공정 흐름
(1kg의 신선한 달걀 흰자를 원료로 사용, 톤 단위로 확장 가능)
1 ) 전처리
- 계란 깨기 → 여과 → 점도를 낮추기 위해 1~2배의 탈이온수로 희석.
- 달걀 흰자 단백질을 완전히 부풀리기 위해 pH를 9.5(1 mol/L NaOH 사용)로 조절합니다.
2 ) 열염 침전물
-
교반하면서 5% NaCl(w/v)을 첨가한 후, 70~75°C까지 계속 가열하고 10분간 유지합니다.
(리소자임은 내열성이 있어 이 조건에서는 변성되지 않습니다)
(열변성으로 인해 오발부민 등의 불순물이 응집되어 침전됨) - 얼음 욕조에서 25 °C로 즉시 냉각하고, 4 °C에서 2시간 동안 방치한 후, 침전된 침전물을 8000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻습니다.
3) 등전점 결정화
- 상층액을 1 mol/L HCl로 pH 10.5로 조정 → 10% NaCl로 포화 → 4 °C에서 48~72시간 방치.
- 리소자임 결정이 침전되고, 원심분리하여 결정을 수집한 다음 0.1 mol/L 인산 완충액(pH 6.5)에 용해합니다.
4 ) 재결정 및 탈색
- 용액의 pH를 다시 9.5로 조정하고, 색소와 기타 단백질을 제거하기 위해 2~3단계를 반복합니다.
- 2차 결정화 후 순도는 95%(SDS-PAGE)에 도달할 수 있으며, 수율은 달걀 흰자 1kg당 0.35~0.45g입니다.
5) 담수화를 위한 초여과/투석
10 kDa 초여과막이나 투석백을 이용하여 24시간 동안 염분을 제거한 후 동결건조하여 흰색 분말을 얻습니다.
6 ) 품질관리
- 특정 활동: ≥9000 U/mg (Microbococcus lysodeikticus 방법)
- 염화물: <3.5%
리소자임의 적용
1. 박테리아 DNA 추출
1 ) 균배양액 0.5~2mL(세포수 2×109 이하)을 취하여 10,000rpm 으로 2분간 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
[ 참고] : 세균 세포의 양이 과도하면 수율이 심각하게 감소하므로 과도해서는 안 됩니다. 초기 처리량은 세균 밀도, 종 등에 따라 달라집니다.
2 ) 먼저 리소자임 완충액을 준비합니다: 20 mM Tris, pH 8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2% Triton X-100, 그런 다음 최종 농도가 20 mg/mL이 되도록 리소자임 건조 분말을 일정량 리소자임 완충액에 첨가합니다.
3 ) 세균, 특히 그람 양성균의 경우 20 mg/mL의 라이소자임 180 μL를 첨가하고 흔들어 현탁시킨 후 37°C 수조 또는 금속 욕조에 30분 이상 담가둡니다.
4 ) Proteinase K(20 mg/mL) 20 μL를 첨가하고 잘 섞이도록 흔든다.
5 ) 잔류 RNA가 후속 실험에 영향을 줄 경우 RNase A(100 mg/mL) 용액을 5 μL 첨가하고 흔들어 잘 섞은 후 실온에서 5~10분간 방치합니다.
6 ) 결합용액 BD 200 μL를 첨가하고, 즉시 흔들어 잘 섞은 후, 70°C 수조 또는 금속조에 10분간 넣어둡니다.
7 ) DNA 흡착 컬럼에 대한 컬럼 평형화를 수행합니다.
8 ) 위에서 식힌 시료 전처리 혼합물에 이소프로판올 100 μL를 첨가하고, 즉시 흔들어 잘 섞은 후, 잠깐 원심분리하여 튜브 캡에 있는 액체를 모읍니다.
9 ) 위 혼합물을 DNA 흡착 컬럼에 넣고 12,000rpm으로 1분간 원심분리한 후, 폐액은 버립니다.
1 0 ) 단백질 제거 용액 500 μL를 첨가하고 12,000 rpm으로 30초간 원심분리한 후 폐액은 버립니다.
11 ) 두 번 헹구세요.
12 ) DNA 흡착 컬럼 중앙에 30~100 µL의 용출액을 넣고 원심분리하여 DNA 용액을 회수합니다.
2. 박테리아 RNA 추출
1 ) 먼저 리소자임 완충액을 준비합니다: 20 mM Tris, pH 8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2% Triton X-100, 그런 다음 최종 농도가 1 mg/mL이 되도록 리소자임 건조 분말을 일정량 리소자임 완충액에 첨가합니다.
2 ) 그람 음성균: 1 mg/mL 라이소자임 작업 용액 100 μL를 첨가합니다. 10초간 볼텍싱한 후 실온에서 2분간 배양합니다. 이 과정을 3회 반복합니다.
3 ) 그람 양성균: 1 mg/mL 라이소자임 작업 용액 100 μL를 첨가합니다. 10초간 볼텍싱한 후 실온에서 2분간 배양합니다. 이 과정을 6회 반복합니다.
[ 참고 ] : 세균수가 5×108 세포 이상일 경우, 리소자임 처리용액의 첨가량은 200 μL입니다.
4 ) 잠시 원심분리하여 세포를 모으고 상층액은 버립니다.
5） 세포를 재현탁시키고 분산시키기 위해 볼텍싱한다. 500 μL의 용해 완충액을 첨가하고, 피펫으로 여러 번 잘 섞은 후, 불용성 물질이 더 이상 없어질 때까지 세게 볼텍싱한다.
6 ) 위의 용해물을 DNA 제거 컬럼에 넣고 12,000rpm으로 1분간 원심분리한 후 여과액을 보관합니다.
7 ) 무수에탄올을 0.5배 용량으로 첨가하고, 즉시 피펫으로 옮겨 잘 섞습니다.
8 ) 위 혼합물을 RNA 흡착 컬럼에 넣고 12,000rpm으로 1분간 원심분리한 후, 폐액은 버립니다.
9 ) 단백질 제거 용액 500 μL를 첨가하고 12,000 rpm에서 30초간 원심분리한 후 폐액은 버립니다.
10 ) 두 번 헹구세요.
1 1 ) RNA 흡착 컬럼 중앙에 효소가 없는 물 30~50 µL를 넣고 원심분리 후 RNA 용액을 회수합니다.
주문 정보
|
제품명 |
제품 번호 |
|
리소자임 |
10402ES |
|
10412ES |
|
|
10406ES |
|
|
MolPure™ 박테리아 DNA 키트 |
18806ES |
|
19301ES |