미토콘드리아는 자가포식, 칼슘 항상성, 면역 반응, 신호 전달, 세포자멸사 등 다양한 세포 과정에 관여합니다. 미토콘드리아 항상성은 세포의 형태, 양, 세포 내 분포, 그리고 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.
에너지 생성 과정에서 미토콘드리아는 미토콘드리아 내막에 전기화학적 전위를 저장합니다. 막을 가로지르는 양성자와 기타 이온의 비대칭적 분포는 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 생성합니다 . 이러한 전기적 특성으로 인해 살아있는 세포의 미토콘드리아는 특정 염료를 선택적으로 유지할 수 있습니다. 따라서 막 전위 의존성 형광 염료는 살아있는 세포 이미징에서 미토콘드리아 a를 표지하는 데 일반적으로 사용됩니다 .
그렇다면 다양한 염료와 프로브 중에서 어떻게 선택해야 할까요? 그리고 비정상적인 표지 결과는 어떻게 처리해야 할까요? 실제 경험에 따르면 표지 결과에 가장 큰 영향을 미치는 요인은 세포 유형 , 형광 프로브 선택 , 그리고 실험 기법 입니다 .
각 측면을 자세히 살펴보겠습니다.
질문 1: 미토콘드리아 형태는 다른 세포 유형에서도 동일합니까?
아래(그림 1)는 30 nM으로 표시된 다양한 세포 유형의 미토콘드리아의 공초점 현미경 이미지를 보여줍니다. TMRM (테트라메틸로다민 메틸 에스테르):
A. HMEC-1(인간 미세혈관 내피세포) : 미토콘드리아는 타원형이고 가지가 많이 갈라져 있어 대사 활동이 활발함을 나타냅니다.
B. 마우스 성상세포 : 미토콘드리아는 풍부하고 균일하게 분포되어 있어 높은 에너지 수요를 반영합니다.
C. INS-1 췌장 β세포 : 미토콘드리아는 인슐린 분비 동안 필요한 에너지에 맞춰 밀집되어 있습니다.
D. 새로 분리한 쥐 간세포 : 미토콘드리아는 더 넓게 분포되어 있으며, 이는 간세포의 복잡한 대사 기능과 관련이 있을 수 있습니다.
그림 1. 30 nM TMRM으로 표지된 4가지 다른 세포 유형의 미토콘드리아의 공초점 이미지.
그림 2에서 MitoTracker Deep Red를 사용하여 HepG2 (위), HeLa (가운데), COS-7 (아래) 세포 의 미토콘드리아를 표지했습니다 . 세포 유형에 따라 형태학적 차이가 다시 한 번 뚜렷하게 나타납니다.
그림 2. 100 nM MitoTracker Deep Red로 표지된 세 가지 세포 유형의 미토콘드리아의 공초점 이미지.
Q2: 미토콘드리아 염색의 종류는 무엇이고 어떻게 분류됩니까?
일반적인 미토콘드리아 프로브는 다음과 같습니다.
미토트래커 시리즈
미토플루어 시리즈
JC-1 / JC-9 / JC-10
로다민 123
티엠알엠
이들은 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 대한 민감도 에 따라 광범위하게 분류 될 수 있습니다 .
1. MMP에 민감하지 않은 프로브:
MitoTracker Green FM : 이 염료는 미토콘드리아 단백질의 시스테인 잔기에 있는 티올(-SH)기와 반응하여 공유 결합 표지를 가능하게 합니다. 막전위와 무관하여 미토콘드리아 형태 (예: 융합 및 분열)와 양 연구에 적합합니다. 그러나 염색 후 신호 손실이 발생하여 고정할 수 없습니다 .
MitoTracker Deep Red FM : MMP에는 민감하지 않지만, 염색 후 4% PFA로 고정 하고 차가운 아세톤으로 투과시킬 수 있습니다 .
2. MMP 민감 프로브:
로다민 123 : 양전하를 띠며, 음전하를 띠는 활성 미토콘드리아에 축적됩니다. 세포자멸사 연구에서 흔히 사용되는데, 세포 자멸사 중 미토콘드리아의 탈분극으로 인해 형광이 현저히 감소하기 때문입니다. 염색 후에 는 고정할 수 없습니다 .
MitoTracker Red CMXRos : 세포 투과성이 뛰어나 활성 미토콘드리아에 선택적으로 축적되며, 호흡 세포에서만 형광을 냅니다. 미토콘드리아의 산화환원 상태를 반영하며 대사 활동 및 산화 스트레스 평가에 적합합니다 . 이 프로브는 염색 후 고정 및 투과성을 조절할 수 있습니다 .
Q3: 고정 후에 미토콘드리아 표지를 할 수 있나요?
아니요 , MitoTracker 및 TMRM과 같은 생세포 미토콘드리아 프로브는 고정된 세포나 조직 샘플에 적합하지 않습니다.
고정된 샘플의 경우 면역 형광 분석 에서 TOM20 이나 Grp75 와 같은 미토콘드리아 특이 항체를 사용하는 것이 좋습니다 .
Q4: 작업 농도가 염색 결과에 영향을 미칩니까?
물론입니다. 세포 유형과 조건에 따라 염료 농도와 배양 시간이 달라 집니다 . 표지 효율에 상당한 영향을 미칩니다. 저농도 사용 시 흔히 발생하는 문제는 다음과 같습니다.
약하거나 없는 형광
성공적으로 라벨링된 세포의 비율이 낮음
미토콘드리아 염료의 농도를 증가시키면 표지 결과가 상당히 향상되는 경우가 많습니다.
Q5: 염색된 생세포를 추가로 배양할 수 있나요?
일반적으로는 그렇습니다. 하지만 몇 시간 동안만 가능합니다.
형광 프로브의 특성상 신호 강도는 시간이 지남에 따라 감소합니다. 흔히 관찰되는 현상 중 하나는 명확한 미토콘드리아 구조가 소실되어 종종 흐릿하고 점상적인 신호가 나타나는 것입니다 .
Q6: 생세포 미토콘드리아 염색약을 파라핀이나 냉동 절편에 사용할 수 있나요?
파라핀 절편 : 고정 및 포매 과정은 막전위를 파괴합니다. 따라서 생세포 염색은 사용할 수 없습니다 . 대신 면역 검출을 위해 미토콘드리아 항체를 사용하는 것이 좋습니다 .
냉동절편 : 어떤 경우에는 미토트래커 딥 레드 샘플의 품질에 따라 시도될 수 있습니다.
Q7: 분리된 미토콘드리아를 생세포 염색약으로 표지할 수 있나요?
네, 막전위가 손상되지 않은 신선하게 분리된 미토콘드리아는 다음과 같은 생세포 프로브를 사용하여 표지할 수 있습니다.
미토트래커 시리즈
로다민 123
JC-1 / JC-9 / JC-10
그러나 냉동되거나 이전에 저장된 미토콘드리아 막의 완전성이 종종 손상되므로 적합하지 않습니다.
참고문헌
Long Dan, Zhou Yanni, Feng Li 외. 세포 및 조직에서 두 가지 미토콘드리아 표지 방법 비교. 쓰촨대학교 의학연구(의과학판) , 2020, 51(3): 388–392. DOI: 10.12182/20200560205
Cottet-Rousselle C, Ronot X, Leverve X, Mayol JF. 형광 프로브를 이용한 미토콘드리아의 세포계측학적 평가. Cytometry A. 2011년 6월;79(6):405–25. doi: 10.1002/cyto.a.21061. PMID: 21595013
제품 개요
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제품명 |
사양 |
카탈로그 번호 |
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1mg/5mg |
40705ES03/08 |
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1mg/5mg |
40707ES03/08 |
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JC-1 미토콘드리아 막 전위 분석 키트 |
100톤 |
40706ES60 |
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로다민 123 |
5 밀리그램 / 25 mg |
40712ES08 /25 |