엑소좀은 세포에서 활발하게 분비되는 막 결합 소포로, 일반적으로 직경이 30~150nm입니다. 엑소좀에는 단백질, DNA, 코딩 및 비코딩 RNA, 지질 등 숙주 세포에서 유래한 다양한 생체 분자가 포함되어 있습니다. 엑소좀은 종양 형성, 성장, 전이, 그리고 질병 진행과 밀접한 관련이 있어 종양 진단 및 치료 분야의 주요 연구 분야로 자리 잡았습니다.
표지된 엑소좀은 수용 세포에 의한 흡수를 연구하고 소동물의 생체 내 분포를 영상화하는 데 일반적으로 사용됩니다 . 그렇다면 엑소좀의 고효율 형광 표지를 보장하기 위한 핵심 요령은 무엇일까요?
Q1: 엑소좀 표지에 어떤 형광염료를 사용할 수 있나요?
친유성 막 염료는 엑소좀 표지에 흔히 사용됩니다. 이 염료는 긴 지방족 꼬리를 엑소좀 막의 인지질 이중층에 삽입하여 강력한 형광 신호를 생성합니다.
일반적으로 사용되는 친유성 형광 프로브는 다음과 같습니다.
PKH67 (녹색; Ex/Em = 490/502 nm)
PKH26 (적색; Ex/Em = 551/567 nm)
DiO (녹색; Ex/Em = 484/501 nm)
DiI (적색; Ex/Em = 549/565 nm)
DiD (원적외선; Ex/Em = 644/663 nm)
DiR (근적외선; Ex/Em = 750/780 nm)
성공적인 표지를 위해서는 적절한 염료를 선택하는 것이 필수적입니다 . DiO와 DiI는 세포 공동 배양 실험에 적합한 반면, DiR은 엑소좀의 생체 내 이미징에 더 적합합니다.
Q2: 적절한 표지 농도를 어떻게 결정합니까?
DiO와 DiI는 일반적으로 세포막 표지에 1~5 μM 농도로 사용되지만, 엑소좀 표지에는 이 농도가 비교적 낮습니다. 높은 표지 효율을 보장하기 위해 DiO, DiI, DiR 모두 100 μM 농도를 사용하는 것이 좋습니다. 이 농도는 효율적인 표지를 촉진하고, 엑소좀에 무독성이며, 염료의 분자량이 작아 제거가 용이합니다.
Q3: 엑소좀 표지에 고정이 필요한가요?
고정이 필요하지 않습니다. 생세포 표지와 유사하게, DiO와 같은 친유성 염료는 고정이나 투과성 조절 없이 엑소좀에 직접 사용할 수 있습니다.
Q4: 엑소좀 양에 비해 권장되는 염색량은 얼마입니까?
염료가 100 μM 작업 용액으로 준비되면 외래소포 단백질 함량에 따라 다음 지침을 따르세요.
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엑소좀 단백질 양 |
염색 작업 용액의 양 |
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10~200μg |
50 μL |
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200~500μg |
100 μL |
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500~1000μg |
200 μL |
Q5: 라벨링을 위한 배양 조건은 무엇입니까?
엑소솜을 염료와 함께 실온 또는 37°C에서 30분 동안 배양합니다 .
Q6: 라벨링 후 자유/결합되지 않은 염료를 제거하는 방법은 무엇입니까?
배양 후, 세척을 위해 라벨 용량의 최소 50배의 PBS를 첨가하십시오. 다음 방법 중 하나를 사용하여 과도한 염료를 제거하십시오.
초원심분리: 120,000 × g 에서 1시간 동안 원심분리합니다 .
한외여과: 100kDa 또는 10kDa 한외여과 튜브를 사용하십시오 . 100kDa 필터는 기공 크기가 약 10nm이므로 표지된 엑소좀은 그대로 두고 자유 염료는 통과시킵니다. 원심분리 후, 내부 튜브를 새 원심분리 튜브에 뒤집어 넣고 다시 원심분리하여 표지된 엑소좀을 수집합니다.
Q7: 라벨링 성공 여부는 어떻게 평가하나요?
표지된 엑소좀은 형광 현미경이나 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 검출할 수 있습니다 . 성공적으로 표지된 엑소좀은 강한 형광을 나타내는 반면, 표지가 실패하면 신호가 거의 또는 전혀 나타나지 않습니다(아래 그림 참조).
Q8: 표시된 엑소좀은 어떻게 보관하나요?
즉시 사용하지 않을 경우, 표지된 엑소좀은 -80°C에 보관할 수 있습니다 . 단기 보관 시에는 4°C가 적합합니다.
결론
엑소좀 표지는 비교적 간단합니다 . 표지 효율의 핵심 결정 요인은 염료와 그 농도입니다. 적절한 염료를 선택하고 최적의 농도를 사용하면 표지 결과를 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 FAQ가 신진 연구자들이 엑소좀 표지를 성공적으로 수행하고 관련 과제를 해결하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 적절한 도구와 방법을 사용하면 연구의 효율성과 효과를 높일 수 있습니다.
참고문헌
[1] Li Ning. 엑소좀 막 형광 분석 및 이미징 방법에 관한 연구 [D]. 대련 이공대학, 2020. DOI: 10.26991/d.cnki.gdllu.2020.004153.
[2] Ma W, Zhang X, Liu Y, et al. 상처 치유를 위한 Fe-MSC 유래 나노소포 캡슐화를 갖춘 폴리도파민 장식 미세바늘. Adv Sci (Weinh) . 2022;9(13):e2103317. doi:10.1002/advs.202103317
[3] Lobb RJ, Becker M., Wen SW, et al. 세포 배양 상층액 및 인간 혈장을 위한 최적화된 엑소좀 분리 프로토콜. J Extracell Vesicles . 2015;4(1):27031.
제품 개요
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제품명 |
사양 |
카탈로그 번호 |
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HieffTM 퀵 엑소좀 분리 키트(혈청/혈장용) |
30ml |
41202ES30 |
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Hieff TM 엑소좀 추적 키트(녹색 형광용) |
20µl |
40781ES20 |
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DiO (DiOC18(3)) |
10mg/25mg |
40725ES10/25 |
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DiI (DiIC18(3)) |
10mg |
40726ES10 |
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DiD 과염소산염(DiIC18(5)) |
25mg |
40758ES25 |
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DiR 요오드화물(DiIC18(7)) |
25mg |
40757ES25 |