Zhang A, Pan S, Zhang Y 외. 실시간 영상, 광열/광역학 및 나노자임 산화 치료를 위한 탄소-금 하이브리드 나노프로브. Theranostics. 2019;9(12):3443-3458. 2019년 5월 24일 게재. doi:10.7150/thno.33266(IF:8.063)
연구자들, 특히 세포생물학과 약리학 분야의 연구자들은 문헌을 읽을 때 아름다운 유세포분석기 세포자멸사 그림을 자주 접하게 됩니다. 다양한 검출 방법 중 Annexin V 기반 유세포분석법은 세포자멸사 평가에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다.
하지만 많은 사람들에게 유세포 분석은 여전히 혼란스러운 기술입니다. 세포자멸사 분석을 추가하면 종종 이상하고 예상치 못한 결과가 나타납니다. 이런 이상한 결과의 문제를 해결하거나 프로토콜을 최적화하려면 어떻게 해야 할까요?
더 이상 걱정하지 마세요. 우리는 Annexin V 세포사멸 검사에서 흔히 발생하는 문제에 대한 포괄적인 목록을 정리했습니다!
운영 섹션
1. Annexin V-FITC/PI 세포사멸 검출의 원리는 무엇입니까?
초기 세포사멸에서 포스파티딜세린(PS)은 세포막 내엽에서 외엽으로 이동합니다. FITC(녹색 형광)로 표지된 아넥신 V는 외엽으로 이동된 PS에 특이적으로 결합하여 초기 세포사멸 세포를 나타냅니다. 적색 형광 DNA 결합 염료인 프로피듐 요오드화물(PI)은 후기 세포사멸 또는 괴사 세포와 같이 세포막이 손상된 세포에만 침투합니다. PI는 488, 532 또는 546 nm 레이저로 활성화될 수 있습니다.
2. Annexin V/PI 세포사멸 키트는 종 특이적입니까?
아니요. Annexin V는 종 전체에서 보존되는 PS에 결합합니다. 따라서 키트는 종 의존적이지 않습니다.
3. EDTA와 함께 트립신을 사용하면 세포사멸 검출에 영향을 미칩니까?
네. Annexin V 결합은 Ca²⁺에 의존합니다. EDTA는 Ca²⁺를 킬레이트화하여 Annexin V와 PS의 상호작용을 방해하고 분석 결과를 저하시킵니다.
4. 세포가 GFP를 발현하는 경우 어떤 세포사멸 키트를 사용해야 합니까?
FITC 표지된 Annexin V(GFP와 동일한 방출량)는 사용하지 마십시오. PE, APC 또는 Alexa Fluor 647로 표지된 키트를 사용하여 스펙트럼 중복을 최소화하십시오.
5. 혈액 샘플에서 혈소판을 제거해야 하는 이유는 무엇입니까?
혈소판에는 PS가 함유되어 있는데, 이는 Annexin V와 결합하여 오도된 결과를 초래할 수 있습니다. 혈소판을 제거하면 간섭을 피할 수 있습니다.
6. Annexin V 염색 시약을 취급할 때 어떤 예방 조치를 취해야 합니까?
Annexin V 염료는 빛에 민감합니다. 염색 및 배양 단계는 어두운 곳에서 수행하고, 최상의 결과를 얻으려면 염색 후 1시간 이내에 샘플을 분석하십시오.
결과 섹션
1. 형광 보상을 올바르게 수행하는 방법은 무엇입니까?
이론적으로는 X-평균과 Y-평균은 같아야 합니다(그림에서 보듯이), 하지만 실제로는 형광 스필오버를 방지하는 것이 목표입니다.
예를 들어, FITC로만 염색된 세포는 PI 양성 사분면에 나타나지 않아야 합니다.
권장되는 제어:
얼룩 없는 제어 : FSC/SSC 및 전압 설정을 조정하여 인구를 정의합니다.
단일 염색 대조군 : 세포사멸을 유도하고 Annexin V-FITC와 PI로 별도로 염색합니다.
이중 염색 샘플 : 대조군에서 최적화된 매개변수를 사용하여 데이터를 수집합니다.
2. 대조군에서 거짓 양성 결과가 나타나는 원인은 무엇입니까?
보정이 제대로 이루어지지 않아 형광이 겹칩니다. 적절한 제어를 사용하여 다시 조정하세요.
과도하게 융합된 세포나 영양실조에 걸린 세포는 자발적으로 세포사멸을 겪을 수 있습니다.
과도한 트립신 처리나 기계적 손상은 막의 완전성을 해칠 수 있습니다.
약물에 의한 형광 방해 또는 세포 자가형광.
염색이나 장기간의 약물 치료 후 지연된 유세포 분석.
3. 치료군에서는 왜 긍정적인 신호가 나타나지 않습니까?
약물 농도나 치료 기간이 부족할 수 있습니다.
상층액에서 세포사멸 세포가 누락되었습니다. 상층액을 항상 포함하십시오.
작동상의 오류: 염색 후 염료를 첨가하지 않았거나 염색 후 염료가 씻겨 나가는 경우.
키트가 손상되었거나 보관이 부적절합니다. 양성 대조군을 사용하여 키트 기능을 확인하세요.
4. 핵 신호만 양성이고 Annexin V는 음성이면 어떻게 되나요?
세포 건강이 좋지 않습니다. 건강한 대수기 세포를 사용하세요.
과도한 피펫팅이나 거친 취급은 삼가해 주십시오. 기계적 손상을 방지하기 위해 조심하십시오.
5. Annexin V만 양성이고 핵염색체는 양성이 아닌 경우는 어떻게 되나요?
핵염색체(PI 또는 7-AAD)가 누락되었을 수 있습니다. 적절한 염색체로 염색을 반복하십시오.
세포는 초기 세포사멸 단계에 있을 수 있습니다. 약물 처리 조건을 조절하고 현미경으로 관찰하세요.
6. 세포 집단이 명확하게 분리되지 않으면 어떻게 되나요?
세포의 자가형광이 신호 전달을 방해할 수 있습니다. 형광단이 겹치지 않는 키트를 선택하세요.
세포 상태가 좋지 않으면 비특이적 PS 노출이 발생할 수 있습니다. 다음과 같은 약한 해리 효소를 사용하세요. 아큐타제 .
요약:
실험 전에 세포에 자가형광이 있는지 확인하고 호환되는 세포사멸 검출 키트를 선택하세요. 순한 성분을 사용하세요. Accutase 와 같은 EDTA가 없는 해리 효소를 사용하십시오. 염색을 생략하지 말고 염색 후 세포를 세척 하지 마십시오 . 분석 중에는 전압과 보상이 올바르게 설정되었는지 확인하고, 키트 성능을 확인하기 위해 항상 양성 대조군을 사용하십시오. 처리군의 경우, 최적의 실험 조건을 결정하기 위해 적절한 농도 및 시간 구배를 설계하십시오.
이런 방법을 사용하면 귀하의 세포사멸 플롯은 최고 수준의 저널에 실린 플롯과 마찬가지로 출판 가치가 있을 수 있습니다!
제품 개요
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카탈로그 번호 |
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Annexin V-PE/7-AAD 세포사멸 검출 키트 |
20T/50T/100T |
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