Annexin V-EGFP/PI 세포 사멸 검출 키트는 EGFP로 표지된 Annexin V를 프로브로 사용하여 조기 세포 사멸의 발생을 검출합니다.
검출 원리는 다음과 같습니다. 정상적인 살아있는 세포에서 포스포티딜세린(PS)은 세포막 안쪽에 위치하지만, 초기 세포사멸 세포에서는 PS가 세포막 안쪽에서 세포막 표면으로 이동하여 세포외 환경에 노출됩니다. Annexin-V는 분자량이 35~36 kDa인 Ca ²⁺ 의존성 인지질 결합 단백질로, PS에 높은 친화도로 결합합니다. 포스파티딜세린은 세포 외부에 노출된 포스파티딜세린을 통해 초기 세포사멸 세포의 세포막에 결합할 수 있습니다.
또한, 프로피듐 요오드화물(PI)은 생존하는 초기 세포와 괴사 또는 후기 세포사멸 세포를 구별하기 위해 제공됩니다.PI는 핵산 염료로, 정상 세포나 초기 세포사멸 세포의 온전한 세포막은 통과할 수 없지만, 후기 세포사멸 및 괴사 세포의 세포막은 통과하여 핵을 붉게 만들 수 있습니다.따라서 Annexin V와 PI를 병용했을 때, PI는 살아있는 세포(Annexin V ^- /PI ^- )와 초기 세포사멸 세포(Annexin V ⁺ /PI ^- )에서 배제되었습니다.후기 세포사멸 및 괴사 세포는 EGFP와 PI에 모두 이중 양성 반응을 보였습니다(Annexin V ⁺ /PI ⁺ ).
이 키트는 유세포분석 및 형광현미경에 적합합니다.

제품 구성 요소

배송 및 보관

구성품은 얼음팩과 함께 배송되며 -20°C에 보관할 수 있습니다. 빛을 피해 보관하고, 1년 동안 반복적인 동결과 해동을 피하세요.
[주의사항]: 단기간 내에 반복적으로 사용해야 할 경우 4℃에서 보관하고 빛으로부터 보호하면 반년 정도 사용할 수 있습니다.

주의 사항

1) 세포사멸은 빠른 과정이기 때문에 염색 후 1시간 이내에 샘플을 분석하는 것이 좋습니다.
2) 부착 세포의 경우 소화는 중요한 단계입니다. 소화액에 EDTA를 사용하지 마십시오. EDTA는 Annexin V와 PS의 결합에 영향을 미칠 수 있습니다.
3) Annexin V-EGFP가 아닌 Annexin V-FITC를 사용하여 세포를 고정해야 합니다. 예를 들어, 세포 사멸과 세포 주기를 동시에 측정하는 데는 Annexin V-FITC를 사용해야 합니다. EGFP는 고정 과정에서 변성되어 형광을 방출하는 능력을 잃기 때문입니다. 고정 전에 세포를 Annexin V-FITC와 함께 배양하고, 결합되지 않은 Annexin V-FITC는 결합 완충액으로 세척하여 제거했습니다. 고정 과정에서 세포 투과성이 증가하면 세포 파편이 생성되어 Annexin V에 결합하여 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
4) 혈액 검체인 경우, 혈액에서 혈소판을 제거해야 합니다. 혈소판에는 PS가 함유되어 있어 Annexin V와 결합하여 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 혈소판은 EDTA가 함유된 완충액을 사용하여 200g에서 원심분리하면 세척할 수 있습니다.
5) 덮개를 열기 전에 시약을 잠깐 원심분리하고, 덮개 안쪽 벽면에 있는 액체를 튜브 바닥으로 쏟아서 덮개를 열 때 액체가 튀는 것을 방지하세요.
6) Annexin V-EGFP 및 PI는 광에 민감한 물질이므로 작동 중에는 빛을 피하십시오.
7) 연구용으로만 사용하세요!

지침

실험 설계
빈 튜브: Annexin V-EGFP와 PI 염색 용액이 없는 음성 대조 세포를 전압 조절에 사용했습니다.
단일 염색 튜브: Annexin V-EGFP만 보충한 양성 대조 세포를 보상을 조절하는 데 사용했습니다.
검출관: 세포를 Annexin V-EGFP와 PI 염색 용액으로 처리했습니다. 실험 데이터는 공시험관과 단일 염색관의 매개변수를 조절하여 얻었습니다.
1.1 샘플 염색
1) 현탁 세포: 세포는 4°C에서 5분간 300g로 원심분리하여 수집했습니다.
부착 세포: EDTA 없이 트립신으로 소화한 후, 4°C에서 5분간 300g로 원심분리하여 세포를 수확했습니다. 거짓 양성 결과를 방지하기 위해 트립신 소화 시간이 너무 길어서는 안 됩니다.
2) 세포를 미리 냉각된 PBS로 300g로 두 번 세척한 후 4℃에서 5분간 원심분리했습니다.
3) 세포를 1×Binding Buffer로 재부유시키고 농도를 1~5×106/mL로 조절했습니다.
4) 100 μL의 세포 현탁액을 5 mL 유세포 분석기 튜브에 넣고, 5 μL의 Annexin V-EGFP를 첨가한 후 세포를 혼합하고, 빛 아래에서 실온에서 5분간 배양했습니다.
5) PI Solution 10 μl와 PBS 400 μl를 첨가하여 즉시 염색을 실시하였다.
[주의사항]: 유세포분석을 이용하여 세포사멸을 검출할 경우 PI는 시간에 큰 영향을 받으며, 시간이 너무 길면 PI 염색이 증가하므로 유세포분석은 1시간 이내에 완료해야 합니다.
1.2 유세포 분석
EGFP의 최대 여기 파장은 488nm, 최대 방출 파장은 507nm였습니다. PI-DNA 복합체의 최대 여기 파장은 535nm, 최대 방출 파장은 615nm였습니다. CellQuest와 같은 소프트웨어를 사용하여 2색 점 그림을 그렸습니다. EGFP는 가로축, PI는 세로축입니다. 샘플당 10,000개의 이벤트를 수집했습니다. 일반적인 실험에서 세포는 세 개의 하위 그룹으로 나눌 수 있습니다. 살아있는 세포는 매우 낮은 강도의 배경 형광만 나타내고, 초기 세포사멸 세포는 강한 녹색 형광만 나타내며, 후기 세포사멸 세포는 녹색과 적색 형광이 이중으로 염색됩니다.