次世代シーケンシング（NGS）は、その高い検出感度、強力な特異性、定性的および定量的検出の両方を実行できることから、病原体検出、腫瘍変異検出、生殖遺伝学などの分野で極めて幅広い臨床および科学研究への応用の見通しを示しています。NGSの中核ステップであるライブラリ構築は、シーケンシングの品質に直接影響します。体外診断（IVD）製品の登録審査ガイドラインに基づいて、主要な原材料の研究データを提供する必要があります。原材料の基本情報、パラメータ指標、供給元などの要素を組み合わせて包括的な分析と検証を行い、最も適切な原材料の供給元を決定する必要があります。従来のDNAおよびRNAライブラリ構築プロセスには、主にcDNA合成、DNA断片化、アダプターライゲーション、ライブラリ増幅などの重要なステップが含まれます。各ステップには、多くの種類の原材料酵素が含まれています。原材料酵素のスクリーニングにより、研究サイクルが長くなります。これに基づいて、費用対効果が高くシンプルなライブラリ構築モジュール製品は、IVD製品の開発における新たな選択肢となっています。
図1. 従来のDNAライブラリ構築プロセス（左）とRNAライブラリ構築プロセス（右）。イルミナプラットフォームを例に挙げる。
逆転写合成はRNA-Seqの中核部分であり、高感度、cDNAの高収量、複雑な構造のテンプレートとの互換性など、複数の機能を統合した新しいタイプの高効率逆転写酵素は研究のホットスポットです。
図2. RNA-seqに適用された13488ESのパフォーマンス
シーケンシング プラットフォームの短い読み取り長の制限により、ライブラリ構築前に DNA をランダムに断片化する必要があります。初期の段階では、酵素による断片化は均一性と偏りの問題により困難でした。
図3. 異なるDNA断片化酵素の断片化効果：強力に作用する断片化酵素（左）と弱く作用する断片化酵素（右）
ライブラリ変換率は、ライブラリの品質を評価するための重要な指標です。ライブラリ変換率が高いということは、ある程度、ライブラリの豊富さとシーケンスデータの均一性が向上することを意味します。従来のT4 DNAリガーゼは、高効率ライゲーションの最適化に重点を置いていますが、フラグメントが自己ライゲーションを起こしやすいため、ライブラリ変換率が低下し、ライブラリの豊富さとシーケンス品質に影響を与えます。
図4. 12996ESの熱安定性とリンカー残基分析
NGS ライブラリ作成方法では、PCR 増幅酵素がすべて必要です。ほとんどの高忠実度 DNA ポリメラーゼは、5'→3' ポリメラーゼ活性と 3'→5' エキソヌクレアーゼ活性を持ち、誤って組み込まれた塩基を修正しながら 5'→3' 方向に DNA を合成できるため、DNA 断片を迅速かつ忠実に増幅できます。しかし、NGS 専用に設計された酵素はほとんどなく、効率的で正確、特異的で、さまざまなサイズや GC 含有量のターゲットを偏りなく増幅でき、同時にプライマーを事前にプレミックスできるライブラリ増幅製品は多くありません。
図5. 12980ESの安定性と増幅エラー率の分析
上記の一連の NGS ライブラリ構築モジュール製品に加えて、さまざまな顧客の複合的なニーズを満たすために、ワンストップの生酵素製品も提供しています。
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製品カテゴリー |
製品名 |
カタログ番号 |
述べる |
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効率的なcDNA合成 |
Hifair™ ウルトラ逆転写酵素（200 U/μL） |
14604ES |
逆転写酵素 |
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Hieff NGS™ ds-cDNA合成キット |
13488ES |
cDNA合成モジュール |
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DNA の断片化と末端修復と A テーリング |
Hieff™ スメラーゼ |
12907ES |
DNA断片化酵素 |
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12619ES |
DNA 断片化 & 末端修復 & A テーリング モジュール |
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修理とA-テーリング |
Hieff NGS® 高速エンド修復/dA-テーリングモジュール |
12608ES |
エンドリペア＆Aテーリングモジュール |
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アダプターライゲーション |
10299ES |
T4 DNAリガーゼ |
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ライブラリの拡張 |
2× Ultima HF 増幅ミックス |
13344ES |
高忠実度酵素 |