ACS Catalysisに掲載
ループ介在等温増幅法（LAMP法）は、その簡便性、効率性、そして精度の高さで高く評価されている強力なDNA増幅法です。卓越した特異性、感度、速度、そして使いやすさにより、LAMP法は分子ポイントオブケア検査（POCT）の基盤となり、疾患診断、遺伝子組み換え食品の検出など、様々な分野における革新を推進しています。この技術の核となるのは、 Bst DNAポリメラーゼです。この酵素の性能（ポリメラーゼ活性、鎖置換能、耐熱性など）は、LAMP反応の速度と精度を直接左右します。
Yeasen氏は、最先端の蛍光活性化液滴選別（FADS）技術を活用し、70℃という高温でのLAMPアッセイを容易にする耐熱性Bst DNAポリメラーゼの開発に成功しました。これにより、LAMPアッセイにおける一般的な偽陽性の問題が解消されました。この研究成果は、生体触媒の主要ジャーナルであるACS Catalysis （インパクトファクター11.3）に掲載されました。
全文については、 https ://doi.org/10.1021/acscatal.4c07614 をご覧ください。
先駆的な技術と専門知識の融合
この酵素は、超ハイスループットFADSプラットフォームによって開発されています。この高度なシステムは、光学、電気、信号取得、マイクロ流体コンポーネントを統合し、液滴生成、マイクロインジェクション、液滴検出・選別のためのカスタム設計チップを備えています。液滴マイクロ流体技術を基盤とするFADSプラットフォームは、膨大な変異体ライブラリの単一細胞レベルのスクリーニングを可能にし、1日あたり1,000万個以上の変異体を比類のない効率で処理します。
図1. FADS超高スループット酵素スクリーニングプラットフォーム
a. システムは、光源、信号発生器、電圧増幅器、デジタル電源、光電子増倍管 (PMT)、データ収集カード、高速カメラなどの主要コンポーネントで構成されています。
b. 液滴生成チップ。
c. 電界トリガー式ピコリットル注入チップ。
d. 蛍光活性化液滴選別チップ。
一方、Yeasen Biotechは、酵素の応用と改変に関する深い専門知識を提供しました。チームは、FADSプラットフォーム向けにカスタマイズされた鎖置換活性プローブを用いて、Bst DNAポリメラーゼの革新的な超ハイスループットスクリーニング戦略を設計しました。セミラショナルデザイン、ランダム変異、DNA組換えを組み合わせることで、単一細胞レベルの微小液滴に封入された変異体ライブラリを構築しました。3回の厳格なスクリーニングを経て、2つの傑出した変異体、M2とM3が最高のパフォーマンスを発揮することが明らかになりました。
図2. FADSによるBst DNAポリメラーゼ分子進化の模式図
a. 半合理的設計により、マルチサイト飽和突然変異誘発ライブラリが確立されました（異なる色は異なるアミノ酸変異を表します）。
b. 最初のスクリーニングラウンドで陽性であった変異体に基づいて、熱安定性を高めるためのランダム変異誘発ライブラリが作成されました（赤い点は前のラウンドで優れた変異部位を示し、他の色の点は追加のアミノ酸変異を表します）。
c. 2 回目のスクリーニングで得られた変異体に対して DNA 組み換えを行ないました (赤い点は、以前のラウンドで特定された高性能の変異部位を示します)。
d. 3回のスクリーニングを経て、耐熱性と鎖置換活性が向上した変異体を分離することに成功しました。
e. ライブラリを大腸菌BL21（DE3）細胞に形質転換した。IPTG誘導後、各細胞はそれぞれ異なるBst DNAポリメラーゼ変異体を発現した（異なる色は異なる変異体を表す）。
f. 個々の細胞を反応系に封じ込めると、プライマー上の消光基により液滴内の蛍光は消失しました。
g. 溶解試薬が細胞構造を破壊し、Bst DNAポリメラーゼを放出して鎖置換反応を引き起こした。その後、プライマーが置換され、液滴内で蛍光発光が引き起こされた。
h. 陽性液滴はFADS選別システムで濃縮されました。
LAMPパフォーマンスの再定義
これらの変異体を基に、私たちは画期的な改善を示す特殊なLAMP反応システムを開発しました。実験結果では、改変変異体は55℃の安定した温度において、特徴的なピーク検出までの時間を35分から10分未満に短縮し、標準的な温度範囲において、広く使用されている輸入Bst 2.0システムの反応速度をはるかに上回ることが明らかになりました。さらに驚くべきことに、これらの変異体は70℃までの極端な温度においても耐性を示し、研究チームは高温LAMP（HT-LAMP）検出技術のパイオニアとなりました。この革新は、従来のLAMP法における長年の課題である偽陽性に対処し、診断精度を劇的に向上させるソリューションを提供します。
図3. FADSシステムの確立と審査プロセス
a. マイクロリアクター内で異なる時点で培養された細胞の明視野画像と蛍光画像。
b. 野生型（WT）および変異体ライブラリを発現するマイクロリアクターの明視野画像および蛍光画像（30分間インキュベート）。
c. 進化の第 1 ラウンドからの陽性株の濃縮。
d. 進化の第 2 ラウンドからの陽性株の濃縮。
e. 進化の第 3 ラウンドからの陽性株の濃縮。
ブレークスルーはそれだけにとどまりませんでした。研究チームは、これらの強化Bst DNAポリメラーゼ変異体をベースにした凍結乾燥LAMP試薬も開発しました。野生型酵素と比較して、これらの変異体は試薬の保存安定性を2桁向上させ、50℃の加速条件下でも6ヶ月以上活性を維持しました。これらの進歩により、進化型Bst DNAポリメラーゼは、LAMPベースのアプリケーションにおいて大きな可能性を秘めた、商業的に実現可能なコア酵素として位置付けられています。
図4. LAMP検出におけるBst DNAポリメラーゼ変異体の性能
a. さまざまな温度での LAMP 検出における Bst DNA ポリメラーゼ変異体のパフォーマンス。
b. NEB の Bst DNA ポリメラーゼ (緑) と比較して、変異体 M2 (オレンジ) および M3 (赤) は、さまざまな温度でさまざまなターゲットに対して著しく高い活性を示しました。
c. 偽陽性実験における変異体M2のパフォーマンス。
d. 偽陽性実験における変異体M3のパフォーマンス。
e. 50°C での熱加速試験における Bst DNA ポリメラーゼ変異体の性能。
新たな洞察の解明
研究者らは、実用化に留まらず、変異体の優れた性能を支える分子メカニズムを深く掘り下げました。解析の結果、鎖置換活性を高める新たなメカニズムが明らかになり、「疎水性ブレード」仮説が提唱されました。この発見は、Bst DNAポリメラーゼのさらなる最適化のための理論的基盤を提供し、将来のイノベーションへの道を開くものです。
図5. Bst DNAポリメラーゼの構造解析
a. Bst DNA ポリメラーゼのサブ構造の図。テンプレートとプライマーによる構造的配置を示しています (PDB: 3TAN)。
b. N204R変異前後の構造変化。
c. I359L変異前後の構造変化。
d. F445I変異前後の構造変化。
e. E461KおよびN462K変異前後の構造変化。
f. D428KおよびY429W変異前後の構造変化。
酵素進化の飛躍的進歩
本研究は、超ハイスループットドロップレットスクリーニングをBst DNAポリメラーゼの進化に初めて適用することに成功したものです。得られた高活性変異体は、LAMP反応時間を劇的に加速し、酵素の熱安定性を向上させ、試薬の長期安定性を確保することで、野生型酵素を商業的に価値のある資産へと変貌させました。これらの成果は、FADS技術が分子酵素進化において変革をもたらす可能性を強く示唆しています。
研究から現実へ
Yeasen Biotechは、この研究に基づき、耐熱性DNAポリメラーゼをHieff Super Bst DNAポリメラーゼ（2,000 U/μL、カタログ番号14410）として市場に投入しました。本製品は、産業用途および研究用途でご利用いただけます。この製品の可能性を探ってみませんか？製品トライアルについては、今すぐお問い合わせください。