T4 RNAリガーゼ2の説明：構造、メカニズム、応用

分子生物学研究という極めて精密な領域において、酵素分子は精巧に設計された「分子ツール」として機能し、数多くの重要な実験手順の成功を支えています。ATP依存性二本鎖RNAリガーゼ（dsRNAリガーゼ）であるT4 RNAリガーゼ2は、その独特な分子構造と効率的な触媒機構により、RNA研究において不可欠な役割を果たしています。この酵素は、分子間および分子内のRNA鎖結合活性を有し、二本鎖RNA（dsRNA）内の切断部位を正確に封鎖するだけでなく、二本鎖構造内のRNAの3'-ヒドロキシル末端とDNAの5'-リン酸基との間の切断結合反応を触媒します。 T4 RNA リガーゼ 2 は、その相同体である T4 RNA リガーゼ 1 と比較すると、一本鎖 RNA の末端を結合するよりも二本鎖 RNA のニックを連結する方が明らかに高い活性を示し、dsRNA ニック連結に関する研究の中心的な酵素ツールとしての地位を確立しています。

図1. T4 RNAリガーゼ2の基質の模式図

• T4 RNAリガーゼ2の構造解析

T4 RNAリガーゼ2は、バクテリオファージT4の遺伝子24.1にコードされており、分子量は約37 kDaで、ATP依存性リガーゼファミリーに属します。その分子構造は、I、III、IIIa、IV、Vを含む複数の高度に保存されたドメインで構成され、これらは三次元空間に精密に配置され、安定したヌクレオチド結合ポケットを形成し、触媒作用のための強固な構造基盤を提供します。重要なのは、

酵素の活性部位内のGlu-34、Arg-55、Lys-209などの重要なアミノ酸残基の正確な空間配置により、T4 RNAリガーゼ2はRNAとDNAの連結反応中に高い触媒活性と基質特異性を発揮することができ、酵素プロセスの正確で効率的な実行を保証します。 ^[1]

図2. T4 RNAリガーゼ2の構造図^[2]

• T4 RNAリガーゼ2の触媒機構

T4 RNA リガーゼ 2 は、3 段階の順序立った触媒反応を通じて隣接するヌクレオチドの連結を達成し、正確な分子レベルの制御を実現します。

1.リガーゼは ATP と反応して酵素-AMP 中間体複合体を形成します。

2. AMP は酵素-AMP 複合体から RNA の 5'-リン酸基に転移され、5'-アデニル化 RNA 中間体が生成されます。

3. 5'-アデニル化されたRNAは隣接するヌクレオチドの3'-ヒドロキシル基と反応してリン酸ジエステル結合を形成し、同時にAMPが放出されます。

図3. T4 RNAリガーゼ2の触媒機構の模式図[3]

YeasenのT4 RNAリガーゼ2（カタログ番号14652）

Yeasen Biotechは、T4 RNAリガーゼ2のコア構造と触媒機構に基づき、発現系と精製プロセスの最適化により、高性能T4 RNAリガーゼ2（Cat#14652）の開発に成功しました。本製品は、酵素本来の触媒活性を維持しながら、多段階の精製プロトコルにより混入するヌクレアーゼによる干渉を排除することで、研究者に安定性と信頼性の高い実験ツールを提供します。以下のセクションでは、ライゲーション活性と純度管理に関する主要な性能特性について説明します。

• 高いライゲーション効率

Yeasen社およびサプライヤーA*社のT4 RNAリガーゼ2を、様々な酵素濃度で二本鎖RNA（dsRNA）基質のライゲーション能について試験しました。その結果、Yeasen社の酵素はdsRNAのライゲーションを効果的に触媒し、試験した全ての濃度においてサプライヤーA*社の酵素と同等のライゲーション効率を示すことが示されました。

図 4. T4 RNA リガーゼ 2 ライゲーション効率の検証。

注意: 20 μL 反応システムには、最終濃度 20 μM dsRNA ライゲーション基質が含まれています。

• 高純度

Yeasenの3つの異なるバッチからT4 RNAリガーゼ2（100 U）をそれぞれ核酸基質とインキュベートし、得られたサンプルをアガロースゲル電気泳動で分析し、バンドパターンを評価しました。その結果、3つのバッチすべてにおいて、エキソヌクレアーゼ、ニッキング酵素、およびRNase活性の混入がないことが示されました。残留ヌクレアーゼが存在しないことで、非特異的酵素活性による干渉のリスクが効果的に排除され、実験アプリケーションにおいて高い忠実性と信頼性が確保されます。

図5. T4 RNAリガーゼ2におけるエキソヌクレアーゼ、切断酵素、およびRNase汚染の検出結果

注文情報

製品名	アプリケーション	カタログ番号
T4 RNAリガーゼ1	1. ssRNA の分子内および分子間連結および環化。 2. ssRNA と ssDNA 間の分子間連結。 3.一本鎖オリゴリボヌクレオチド（ssOligo RNA）の合成。 4.クローニング、ライブラリ構築、PCR 検出、および cDNA ライブラリの調製のために、miRNA などの RNA の 5' 末端にアダプターを連結します。	14651ES
T4 RNAリガーゼ2	1. dsRNA の切断部分の連結。 2.二重鎖構造内の RNA の 3'-ヒドロキシル基と DNA の 5'-リン酸基の間のニック結合。 3. RNA スプリントの支援による ssRNA 末端結合の促進。	14652ES

 

拡張読書

1. siRNA の合成と T4 RNA リガーゼ 2 の役割。

2. T4 DNA リガーゼの概要。

参考文献

[1] Yin S, Ho CK, Shuman S. T4 RNAリガーゼ2の構造機能解析[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(20): 17601-17608.

[2] Easey A. T4 RNAリガーゼ活性を最適化する合成生物学的手法[D].イースト・アングリア大学, 2018.

[3] Viollet S, Fuchs RT, Munafo DB, et al. T4 RNAリガーゼ2の活性部位切断変異体：RNA分析のための改良ツール[J]. BMCバイオテクノロジー, 2011, 11: 1-14 .