生物学におけるテロメアとプロテロメラーゼというと、多くの人がまず思い浮かべるのは、避けられない自然現象である老化です。テロメアとは、真核生物の染色体末端にあるDNAの反復配列であり、染色体の完全性を維持し、細胞分裂周期を調節する役割を担っています。
プロテロメラーゼは、テロメアを延長する逆転写DNA合成酵素です。RNAとタンパク質からなる核タンパク質で、タンパク質成分はRNA成分と共にテロメア反復配列の合成を触媒します。

図1. プロテロメラーゼによるテロメア伸長のメカニズム[1]
プロテロメラーゼはテロメアを修復・延長し、DNA複製の欠陥を補い、細胞分裂中のテロメアの喪失を防ぎ、細胞分裂回数を増加させます。2009年、細胞機能と老化におけるテロメアとプロテロメラーゼの重要な役割を解明した卓越した貢献により、エリザベス・H・ブラックバーン、キャロル・W・グライダー、ジャック・W・ショスタックの3名にノーベル生理学・医学賞が授与されました。
本日は、ユニークなプロテロメラーゼ、TelNプロプロテロメラーゼをご紹介します。TelNプロテロメラーゼはバクテリオファージN15に由来し、N15複製システムの構成要素として、直鎖状プロファージDNAの生成に関与しています。真核生物のプロテロメラーゼとは異なり、TelNはRNA成分を含まない純粋なタンパク質酵素です。切断-ライゲーション活性を有し、二本鎖DNA(dsDNA)を切断した後、切断部位に共有結合した閉鎖末端を残します。

図2. TelNプロテロメラーゼ切断部位
TelNプロテロメラーゼの作用機序
TelNプロテロメラーゼの認識部位は56bp長の回文配列であり、その両側にはtelRとtelLが存在します。標的配列の中央位置も回文配列telOです。TelNプロテロメラーゼはtelO配列内で切断を行い、切断端の両端に共有結合で閉じたヘアピン構造を形成します。切断後のDNA末端は依然としてtelRとtelLで構成されており、ドギーボーンDNA(dbDNA)と呼ばれます。

図3. TelN部位におけるプロテロメラーゼ切断機構[2]
TelNプロテロメラーゼの特殊な酵素切断-連結活性により、環状プラスミドDNAはワンステップ酵素反応で共有結合で閉じた直線状のダンベル型分子に変換できます。直線状のオープンDNA分子と比較して、直線状のクローズドDNAは細胞内でのタンパク質発現レベルが高く、安定性が高く外来配列が最小限の直線状のクローズドエンドミニDNAの構築に非常に適しています。プラスミドDNAは、mRNAワクチン、DNAワクチン、細胞遺伝子治療の中核要素として重要な役割を果たしています。従来のプラスミド製造方法は、大腸菌による発酵と多段階増幅を伴い、発酵プロセスで制御できないリスクが高品質のプラスミドの収量を制限し、ワクチンの生産能力を制限する鍵となります。英国のタッチライト社は革新的なdbDNA技術を発表しました。この技術は、プラスミドDNA調製のための従来の細菌発酵方法を破壊し、DNAのin vitro酵素合成を使用する代わりになります。上記の方法では、直鎖状のクローズドエンドミニ DNA を生成するために、 TelN プロテロメラーゼの特殊な酵素切断-連結活性も利用されます。
DNA酵素合成におけるTelNプロテロメラーゼの応用
phi29 DNAポリメラーゼとTelNプロテロメラーゼをベースとしたin vitro酵素法によるDNA合成は、生物学的発酵プロセスにおける多くの制御不能なリスクを回避し、高速かつ高収率でDNAを合成することができます。合成されたDNAは、mRNAワクチン、DNAワクチン、遺伝子治療ベクター、遺伝子編集など、多くの新興技術に応用可能です。

図4. DNA酵素合成のフローチャート[3]
酵素によるDNA合成プロセス
- テンプレートの変性
環状プラスミド DNA テンプレートは、変性プロセスによって 2 つの一本鎖環状 DNA に変換されます。
- ローリングサークル増幅
Phi29 DNA ポリメラーゼと一本鎖環状 DNA を使用してローリング サークル増幅を実行し、プロテロメラーゼ認識配列間隔を持つ長い直線状の二本鎖連結 DNA を生成しました。
- 切断と共有結合による閉鎖
TelN プロテロメラーゼは、テロメア複合体の DNA 上の telRL を認識し、切断-連結活性を実行して、線状で共有結合した DNA モノマーを生成します。
- 細菌骨格DNAの除去
制限酵素または制限酵素は、末端に開放構造を持つ細菌骨格DNAを分解し、標的遺伝子発現要素のみを含むDNAを生成します。酵素によるDNA合成技術は、生物学的発酵を回避し、GMPレベルのプラスミドDNA合成を迅速に達成できるため、遺伝子治療やmRNAワクチン分野における生産能力の限界を解決し、産業化への大きな可能性を秘めています。YEASEN Biologyは、DNA酵素合成技術の発展を促進するため、phi29 DNAポリメラーゼ(14404ES)やTelNプロテロメラーゼ(14540ES)などのDNA酵素合成コア酵素材料を提供し、DNA酵素合成技術の研究と生産を支援します。
YEASENのTelNプロテロメラーゼの性能プレゼンテーション
- 切断結紮性能は優れており、輸入ブランドに匹敵します。
TelNプロテロメラーゼ認識部位を含むスーパーコイルプラスミドを鋳型として、YEASENの勾配添加酵素(0.078~5 U)とブランドAを添加した。0.5 μgのスーパーコイルプラスミドを閉鎖型直鎖二本鎖DNA(dsDNA)に変換した。ゲル電気泳動を用いて変換効率を測定した結果、YEASENのTelNプロテロメラーゼの切断活性およびライゲーション活性はブランドAと同等であることが示された。

図5. TelNのプロテロメラーゼ切断活性検出 M:マーカー、C:スーパーコイルプラスミドコントロール
- 線状dsDNAの閉鎖完全性 > 90%
TelNプロテロメラーゼ認識部位を含むスーパーコイルプラスミドを鋳型とし、YEASENのTelNプロテロメラーゼとブランドAを添加し、0.5μgのスーパーコイルプラスミドを閉鎖直鎖dsDNAに変換した。その後、T5エキソヌクレアーゼを添加し、バンド分解度合いから末端の完全性を確認した。その結果、YEASENのTleNプロテロメラーゼによって生成されたdsDNA末端閉鎖完全性は90%を超え、ブランドAと同等であることが示された。

図 6. TelN プロテロメラーゼ末端閉鎖完全性試験。C1: TelN 認識部位を含むプラスミド (TelN プロテロメラーゼなし)。C2: TelN 認識部位と TelN プロテロメラーゼを含むプラスミド (T5 エキソヌクレアーゼなし)。プラスミド: TelN 認識部位を含むプラスミド。
DNA酵素合成関連製品
製品分類 |
製品名 |
カタログ番号 |
プロテロメラーゼ |
14540ES |
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ファイ29 DNAポリメラーゼ |
14404ES |
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エキソヌクレアーゼ |
14525ES |
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14538ES |
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リガーゼ |
10301ES |
|
dNTP |
11867ES |
|
dNTP |
dNTPミックス(50mM) |
16932ES(お問い合わせ) |
ランダムプライマー |
17293ES |
参照
[1] ジャルディーニ MA、セガット M、ダ シウバ MS、ヌネス VS、カノ MI。テロメアとプロテロメラーゼの生物学。 Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40。
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. 原核生物の切断結合酵素TelNによって生成された線状閉鎖ミニDNAは哺乳類細胞で機能する。J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. 原核生物の切断結合酵素TelNによって生成される直鎖状閉鎖ミニDNAは哺乳類細胞で機能する. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.