Структура Cap является важным компонентом в разработке вакцин и терапевтических средств на основе мРНК. Технология синтетической мРНК опирается на Cap1 для повышения стабильности, эффективности трансляции и снижения врожденного иммунного распознавания мРНК толл-подобными рецепторами (TLR) и другими иммунными сенсорами, сводя к минимуму нежелательную иммунную активацию. Это предотвращает нежелательные воспалительные реакции, тем самым улучшая стабильность и эффективность терапевтической мРНК в клетках человека.
Раннее открытие и структура Cap0
В середине 1970-х годов исследования эукариотической мРНК обнаружили 5'-концевую структуру, теперь известную как Cap0, где к первому нуклеотиду на 5'-конце присоединен N7-метилгуанозиновый колпачок (m7G). Было обнаружено, что эта модификация защищает мРНК от деградации экзонуклеазами, способствует ядерному экспорту и способствует распознаванию рибосомы для инициации трансляции. Cap0 была первой охарактеризованной кеп-структурой, причем ее метилирование ограничивалось самим гуанозиновым колпачком. Открытие этого 5'-колпачка и его функций ознаменовало значительный прорыв в понимании кэпов эукариотической мРНК и их роли в модификациях мРНК.
Появление Cap1
Структура Cap1, критическая особенность эукариотической мРНК, играет ключевую роль в стабильности мРНК, трансляции и иммунном распознавании. Структура кэпа мРНК, состоящая из N7-метилгуанозина (m7G), связанного с первым нуклеотидом через 5'-5' трифосфатную связь, возникла в результате ранних исследований посттранскрипционных модификаций эукариотической мРНК в 1970-х годах.
Структура мРНК с кэпом на 5′-конце.【1】 Дальнейшие исследования показали, что в большинстве эукариотических мРНК первый нуклеотид, следующий за кэпом (позиция +1), также метилирован в позиции 2'-O рибозы, процесс, известный как 2'-O-метилирование. Это открытие, известное как структура Cap1 (m7GpppNm), добавило еще один уровень функциональной значимости к модификациям мРНК. Было обнаружено, что модификация Cap1 тонко настраивает стабильность мРНК и предотвращает иммунное распознавание врожденной иммунной системой, особенно в клетках млекопитающих, где она помогает избегать распознавания рецепторами распознавания образов, такими как RIG-I, TLR и MDA5【2】. Это имело решающее значение как для метаболизма мРНК, так и для развития технологий на основе мРНК, включая вакцинацию мРНК и применение генной терапии.
Технические проблемы в индустрии мРНК и текущие решения
Несколько технических проблем остаются в широком применении и оптимизации вакцин мРНК, включая проблемы с высокой дозой мРНК, иммунными реакциями, стабильностью и доставкой. Значительной проблемой в индустрии мРНК является необходимость в высоких дозах мРНК для получения сильного иммунного ответа. Это обусловлено несколькими факторами:
Быстрая деградация: мРНК по своей природе нестабильна и подвержена деградации под действием ферментов декэпирования и рибонуклеаз (РНКаз), присутствующих в биологических системах.
Ограниченная эффективность перевода: Эффективность, с которой мРНК транслируется в белок, может варьироваться, требуя большего количества мРНК для генерации достаточных уровней антигена для иммунного ответа. Эффективность трансляции связана со сродством Cap1 и фактора инициации трансляции eIF4E.
Формирование основного комплекса инициации трансляции у эукариот.【3】
Иммуногенность и нежелательные иммунные реакции: Третьей по величине преградой является врожденный иммунный ответ, который может быть вызван самой мРНК, особенно для dsRNA или неполной мРНК. Хотя определенный уровень иммунной активации желателен для стимуляции адаптивной иммунной системы, чрезмерная активация может привести к воспалительным реакциям, которые могут снизить эффективность вакцины или вызвать побочные эффекты.
История технологии укупорки
-
Технология ферментативного укупоривания: Ферментативное кэпирование, введенное на ранних этапах исследований мРНК, включает использование кэпирующих ферментов, таких как гуанилилтрансфераза и метилтрансфераза, для добавления естественного 5'-кэпа посттранскрипционно. Этот метод обеспечивает высокую точность и эффективность кэпирования при трансляции мРНК, особенно для терапевтических применений.
-
Аналоги синтетических колпачков (1980-е-2000-е годы): Исследователи разработали синтетические аналоги кэпа для синтеза in vitro кэпированной мРНК, помогая изучать функцию мРНК и экспрессию генов. Аналог антиобратного кэпа (ARCA) — это синтетический аналог кэпа, разработанный для предотвращения неправильного включения кэпа во время синтеза мРНК, что повышает эффективность трансляции мРНК для вакцин и генной терапии. Однако эффективность кэпирования и выход кэпирования ARCA низкие.
-
Технология Cap1 (2010-е): TriLink Cap1 — это метод котранскрипционного кэпирования, который упрощает процесс за счет включения кэпа непосредственно во время синтеза мРНК. Этот метод повышает эффективность и дает высокий процент правильно кэпированной мРНК, что делает его идеальным для крупномасштабных терапевтических приложений, таких как вакцины мРНК.
В настоящее время технологии ферментативного кэпирования играют решающую роль в разработке методов лечения на основе мРНК, включая вакцины против COVID-19, обеспечивая стабильность и эффективную трансляцию терапевтической мРНК.
Сравнение ферментативного укупоривания, следующего поколения Метод укупорки LZCap и метод укупорки первого поколения (ARCA)
Разработка аналогов колпачков следующего поколения
Мы стремились разработать аналоги кэпа с устойчивостью к ферментам декапирования, высоким сродством к eIF4E для повышения эффективности трансляции и более низкой иммуногенностью. Эти достижения имеют решающее значение для повышения эффективности терапии на основе мРНК, включая противораковые методы лечения и применение генной терапии.
Проектирование LZCap
При проектировании LZCap мы в основном сосредоточились на создании аналога кэпа с высоким сродством к eIF4E. Ферменты обладают относительно «специфическим» распознаванием субстратов. Поэтому при проектировании новой структуры кэпа мы стремимся максимально сохранить сходство с природными/известными структурами. Природная структура имеет рибозу 3' OH, которая может быть модифицирована (например, метилированием). Исходя из этого соображения, мы решили добавить углерод в положение 3' для новизны, затем NH для имитации водородной связи OH, а затем ацетильную группу для снижения основности NH и повышения ее способности к водородным связям. Активность LZCap лучше, чем у метилированного природного кэпа, возможно, из-за увеличения водородных связей. По сравнению с метильной и метоксигруппами ацетиламиногруппа также может усиливать ван-дер-ваальсовы взаимодействия между субстратом (кэпом) и инициирующим фактором (ферментом).
Стабильность ацетиламиногруппы
Ацетиламиногруппа уже достаточно стабильна. Она гораздо стабильнее, чем 7-метилированное положение и фосфодиэфирная связь, которые являются наименее стабильными частями колпачка.
Эффективность выхода и укупорки LZCap
С колпачком LZCap AG(3'Acm) эффективность колпачка мРНК люциферазы составляет около 97,59%, и до 200 мкг колпачка мРНК может быть получено с 1 мкг ДНК-матрицы в стандартной реакции транскрипции in vitro (IVT) с РНК-полимеразой T7. Чистота мРНК составляет до 99% после простого осаждения LiCl. Такая высокая эффективность колпачка и выход делают LZCap привлекательным вариантом для различных применений, включая производство белка и генную терапию.
Структура Cap является важнейшим компонентом при разработке мРНК-вакцин и терапевтических средств.Технология синтетической мРНК опирается на Cap1 для повышения стабильности, эффективности трансляции и снижения врожденного иммунного распознавания мРНК толл-подобными рецепторами (TLR) и другими иммунными сенсорами, сводя к минимуму нежелательную иммунную активацию. Это предотвращает нежелательные воспалительные реакции, тем самым улучшая стабильность и эффективность терапевтической мРНК в клетках человека.
| Продукт | Крышка АГ (3'-ОМе-7мГ) | LZCap AG(3'Acm) | АГ (без ограничения) |
| выход мРНК (мкг) | 164 | 173 | 200 |
MS-анализ эффективности кэппинга LZCapped Luciferase mRNA с использованием метода на основе РНКазы H. Эффективность кэппинга составляет около 97,59%.
Какова стабильность мРНК по отношению к ферменту декепирования?
мРНК с LZCap AG(3'Acm) и LZCap AG M6 (3'Acm) проявляют более высокую устойчивость к декапированию ферментом (NEB). Отмечено, что CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) также устойчив к декапированию ферментом, но обычный Cap AG (3'-OMe-7mG) не проявляет устойчивости.
Какова связывающая способность LZCap с eIF4E?
А как насчет экспрессии белка LZCap AG(3'Acm)-кэпированной мРНК?
Экспрессия LZCap AG(3'Acm) capped люциферазы мРНК значительно выше, чем у аналога Cap1 (3'-OMe-7mG) capped люциферазы мРНК в различных клеточных линиях* (3T3-L1，Hela，JAWs，HEK293T и Huh7). Эксперимент с 130 повторениями показал примерно в 1,5 раза более высокую экспрессию LZCap AG(3'Acm) capped люциферазы мРНК, чем (3'-OMe-7mG) capped мРНК в среднем. Похожий результат наблюдается у мышей. Уровень экспрессии белка может немного отличаться в зависимости от последовательности мРНК.
Есть ли у вас дополнительные данные по животным?
Эффективность экспрессии LZCap AG(3'Acm) или LZCap AG(3'FMom) кэппирована
мРНК, кодирующая GLuc, демонстрирует более высокую экспрессию in vivo по сравнению с мРНК, кэпированными CapAG (3'-OMe-7mG), у яванского макака и свиньи.
А как насчет врожденной иммуногенности мРНК, покрытых LZCap AG?
LZCapAG (3'Acm) кэпированные мРНК демонстрируют низкую врожденную иммуногенность. TLR8, TLR7, IL-1A и B играют важную роль в иммунном ответе, вызванном некэпированной РНК. Исследования in vivo анализа иммуногенности LZCapped мРНК показали, что некэпированная РНК вызвала значительные изменения в уровне транскрипции факторов, связанных с иммунитетом, у мышей. Как LZCap, так и 3'-OMe-7mG кэпированные мРНК демонстрируют схожий более низкий уровень транскрипции иммунных факторов у мышей после однократной инъекции, стимулированной РНК.
Вы проводили тест на безопасность?
Да, мы провели тест на цитотоксичность, исследование ингибирования полимеразы человека и тест Эймса.
- Не наблюдалось никакой цитотоксичности или наблюдалась незначительная цитотоксичность для нуклеозидного мономера 3'-Acm-7mG (CC50＞10000 нМ) в клетках 293T, Huh7, MRC5, THP1 и U87MG.
- ДНК-полимераза человека (α,β, γ и Кленова) и исследования ингибирования активности митохондриальной РНК-полимеразы (hPOLRMT) показывают, что 3'-Acm-7mG TP не ингибирует человеческую ДНК или РНК-полимеразу.
- Тест на обратную мутацию бактерий (Эймса) выявляет сопутствующие генетические изменения, а также генотоксичные канцерогены у большинства грызунов и людей. Тест Эймса показал, что 3'-Acm-7mG не обладает генотоксичностью.
Запатентован ли этот продукт?
Да. Патент выдан в США.
Информация о заказе
| Название продукта | Технические характеристики | Номер по каталогу |
| LZCap АГ(3'Асм)（ 100 мМ) | 100 мкл, 1 мл | 10684ES |
| LZCap AU(3'Асм)（ 100 мМ） | 100 мкл, 1 мл | 10685ES |
| LZCap ГГ(3'Асм)（ 100 мМ) | 100 мкл, 1 мл | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 мМ) | 100 мкл, 1 мл | 10688ES |
| LZCap АГ(3'Ма-Cy7)（ 25 мМ） | 100 мкл, 1 мл | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 мМ) | 100 мкл, 1 мл | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-биотин) (25 мМ) | 100 мкл, 1 мл | Расследование |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 мМ) | 100 мкл, 1 мл | Расследование |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 мМ) | 100 мкл, 1 мл | язапрос |
| LZCap (AG(3'Acm) Светлячок luc мРНК (1 мкг/мкл) | 100 мкл, 1 мл | язапрос |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP мРНК (1 мкг/мкл) | 100 мкл, 1 мл | язапрос |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1 мкг/мкл) | 100 мкл, 1 мл | язапрос |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP мРНК (1 мкг/мкл) | 100 мкл, 1 мл | Расследование |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 мРНК (1 мкг/мкл) | 100 мкл, 1 мл | язапрос |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc мРНК (1 мкг/мкл) | 100 мкл, 1 мл | язапрос |
Ссылка:
- Молекулярные механизмы кэпирования и метилирования РНК коронавируса, Virologica Sinica 31(1)
- мРНК-вакцины — новая эра в вакцинологии. Нац. преподобный д-р Дисков. 17, 261–279 (2018).
- Инициация трансляции, регулируемая РНК-связывающим белком у млекопитающих: модуляция комплекса инициации трансляции транс-действующими факторами, клетками 2021, 10(7), 1711