설명
Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 WST-8(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt) 시약을 기반으로 하는 빠르고 민감한 검출 키트입니다. WST-8은 MTT의 업그레이드된 시약으로, 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 수용성이 높은 주황색-노란색 포르마잔으로 환원될 수 있습니다. 생성되는 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 비례합니다. 마이크로플레이트 리더로 검출된 450nm에서 포르마잔의 OD 값은 생존 세포의 수를 간접적으로 나타낼 수 있습니다. 이 키트는 약물 스크리닝, 세포 증식 및 세포독성 분석, 종양 약물 감수성 검사, 생물학적 인자의 활성 검출에 널리 사용됩니다.
CCK-8 방식의 장점
1. CCK-8 방법과 다른 세포 증식/독성 검출 방법의 비교.
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검출 방법 |
MTT 방법 |
XTT 방법 |
WST - 1 방법 |
CCK 8 방법 |
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포르마잔 생성물의 수용성 |
낮음(유기용매를 첨가하여 녹인 후 테스트해야 함) |
높은 |
높은 |
높은 |
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제품 특성 |
가루 |
용액 2병 |
해결책 |
용액 1병 |
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사용 방법 |
용액에 섞어서 사용하세요 |
이 용액은 사용 직전에 준비되었습니다. |
상자 밖으로 |
상자 밖으로 |
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검출 감도 |
높은 |
매우 높음 |
매우 높음 |
높은 |
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감지 시간 |
긴 |
짧은 |
짧은 |
가장 짧은 |
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검출 파장 |
560-600nm |
420-480nm |
420-480nm |
430-490nm |
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세포독성 |
독성이 강하고 세포 형태가 완전히 사라짐 |
독성 낮음, 세포 형태 변화 없음 |
독성 낮음, 세포 형태 변화 없음 |
독성 낮음, 세포 형태 변화 없음 |
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시약 안정성 |
일반적인 |
낮은 |
일반적인 |
높은 |
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대량 샘플 테스트 |
실행할 수 있는 |
적절한 |
적절한 |
적절한 |
2. 페놀레드와 혈청은 CCK-8 검출에 방해를 주지 않습니다.
3. CCK-8 시약의 세포독성은 매우 낮으므로, CCK-8 시약을 첨가한 후 여러 차례 마이크로플레이트 리더로 반복적으로 판독하여 최적의 측정 시간을 결정할 수 있습니다.
배송 및 보관
이 제품은 -25~-15ºC의 건조하고 어두운 곳에 보관하면 2년간 보관이 가능합니다.
지침
1. 첫 번째 실험에서는 최적의 세포 도말 수와 CCK-8 시약의 최적 배양 시간을 결정하는 것이 좋습니다.
2. 가능하면 반복 웰 간 편차를 줄이기 위해 다중 채널 피펫을 사용하십시오. 실험 중 기포가 발생하면 OD 측정에 영향을 미치므로 주의하십시오. CCK-8 시약을 첨가할 때는 배양 배지에 직접 넣지 않고 배양 플레이트 벽면 가까이에 넣는 것이 좋습니다.
3. 백혈구는 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다.
4. 표준 96웰 플레이트를 사용하는 경우, 도말하는 세포 수는 최소 1,000개/웰(100 μL)이어야 합니다. 백혈구의 검출 감도는 상대적으로 낮으므로 최소 2,500개/웰(100 μL)을 도말하는 것이 좋습니다. 24웰 또는 6웰 플레이트를 사용하는 경우, 각 웰의 세포 수를 계산하고 적절한 양의 CCK-8 시약을 첨가합니다(첨가하는 CCK-8 시약의 양은 플레이트 각 웰의 배양 배지 양의 10%입니다).
5. 450nm 필터를 사용할 수 없는 경우 흡광도가 430~490nm인 필터를 사용할 수 있지만, 450nm 필터를 사용하면 가장 높은 검출 감도를 얻을 수 있습니다.
6. 페놀 레드는 측정에 영향을 미치지 않습니다. 왜냐하면 페놀 레드의 매질 내 흡광도는 공백 그룹의 흡광도를 빼면 제거되기 때문입니다.
7. 실험 진행 시에는 안전과 건강을 위해 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용해 주시기 바랍니다.
지침
I. 표준곡선을 만듭니다
1. 세포 현탁액을 준비하고 세포 밀도를 측정한 후 세포를 도금합니다.
2. 세포를 특정 비율(예: 1:2 비율)에 따라 배양 배지로 순차적으로 희석하여 세포 농도 구배를 형성합니다. 일반적으로 3~5 세포 농도 구배, 각 농도에 대해 3~6개의 복제 웰을 사용합니다.
3. 도말 후, 세포를 2~4시간 동안 배양하여 부착시킵니다. 그런 다음 CCK-8 시약을 첨가하고 일정 시간 동안 배양한 후 OD 값을 측정합니다. 세포 수를 X축으로, OD 값을 Y축으로 하는 표준 곡선을 그립니다. 이 표준 곡선을 통해 미지 시료의 세포 수를 측정할 수 있습니다. (이 표준 곡선을 사용하는 전제는 실험 조건이 일정해야 한다는 것입니다.)
II. 세포 생존율 분석
1. 96-웰 플레이트에 세포(100 μL/웰)를 도말합니다. 플레이트를 배양기(37°C, 5% CO 2 )에 넣고 일정 시간 동안 전배양합니다.
2. 각 웰에 CCK-8 시약 10 μL를 첨가합니다(웰에 거품이 생기지 않도록 주의하세요. 거품은 OD 판독을 방해할 수 있습니다). 그리고 부드럽게 섞습니다.
3. 접시를 인큐베이터에 넣고 1~4시간 동안 배양합니다.
4. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정합니다.
5. OD 값이 즉시 측정되지 않으면, 각 웰에 0.1 M HCl 용액 또는 1% w/v SDS 용액 10 μL를 넣고 플레이트를 덮은 후, 빛이 차단된 실온에서 보관하십시오. 흡광도는 24시간 이내에 변하지 않습니다.
III. 세포 증식 및 세포독성 분석
1. 96-웰 플레이트에 세포(100 μL/웰)를 도말합니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO 2 )에 넣고 24시간 동안 전배양합니다.
2. 시험할 물질의 농도를 다르게 하여 10 μL씩 플레이트에 첨가합니다.
3. 접시를 배양기에 넣고 일정 시간(예: 6시간, 12시간, 24시간 또는 48시간) 동안 배양합니다.
4. 각 웰에 CCK-8 시약 10 μL를 첨가합니다(OD 판독을 방해할 수 있으므로 웰에 거품이 생기지 않도록 주의합니다).그리고 부드럽게 섞습니다.
5. 접시를 인큐베이터에 넣고 1~4시간 동안 배양합니다.
6. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정합니다.
7. OD 값이 즉시 측정되지 않으면, 각 웰에 0.1 M HCl 용액 또는 1% w/v SDS 용액 10 μL를 넣고 플레이트를 덮은 후, 빛이 차단된 실온에서 보관하십시오. 흡광도는 24시간 이내에 변하지 않습니다.
참고: 물질이 산화 또는 환원 반응을 일으키는 경우, 물질의 영향을 제거하기 위해 CCK-8 시약을 첨가하기 전에 기존 배지를 새 배지로 교체하십시오(기존 배지를 제거하고, 세포를 새 배지로 두 번 세척한 후 새 배지를 첨가하십시오). 물질 자체가 흡광도에 미치는 영향이 미미한 경우, 배지를 교체할 필요가 없으며, 공시험군에서 해당 물질을 제거하여 물질의 영향을 제거할 수 있습니다.
계산식
세포 생존율 = [(AC) /(BC)] x 100%
억제율 = [(BA) /(BC)] x100%
A: 실험군의 흡광도(세포가 들어있는 배양액, CCK-8 시약, 그리고 시험물질의 흡광도)
B : 대조군의 흡광도(세포가 들어있는 배양액, CCK-8 시약의 흡광도)
C: blank group의 흡광도(CCK-8 시약이 포함된 배양액의 흡광도)
인용문
서류:
인용 및 참조:
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