설명
T7 고수율 RNA 합성 키트는 전사 반응 시스템을 최적화합니다. 이 키트는 T7 RNA 중합효소, T7 프로모터 서열을 주형으로 하는 선형 이중 가닥 DNA, 그리고 프로모터 하류의 DNA 서열을 조절하는 기질인 NTP를 사용하여 단일 가닥 RNA를 효율적으로 합성할 수 있습니다. 전사 과정에서 변형된 뉴클레오타이드를 기질에 첨가하여 바이오틴 또는 염료로 표지된 RNA를 제조할 수 있습니다.
이 키트는 긴 전사체와 짧은 전사체를 합성할 수 있으며, 1μg의 DNA 주형을 투입하여 100~200μg의 RNA를 생산할 수 있습니다. 전사를 통해 합성된 RNA는 RNA 구조 및 기능 연구, RNase 보호, 프로브 혼성화, RNAi, 미세주입, 시험관 내 번역 등 다양한 후속 연구에 사용될 수 있습니다.
그림 1: 시험관 내 RNA 전사 과정
특징
- 1μg의 제어 템플릿에서 반응당 최대 180μg의 RNA
- IVT 공정을 위한 최적화된 반응 시스템
- dsRNA 생산 감소
- 더 높은 RNA 무결성 및 순도
애플리케이션
- 시험관 내 RNA 합성
구성 요소
| 구성품 번호 | 이름 | 10623ES50(50톤) | 10623ES60(100톤) | 10623ES70(500톤) |
| 10623-A | T7 RNA 중합효소 혼합물 | 100 μL | 200 μL | 1mL |
| 10623-B | 10×전사 완충액 | 100 μL | 200 μL | 1mL |
| 10623-C | ATP(100mM) | 100 μL | 200 μL | 1mL |
| 10623-D | CTP(100mM) | 100 μL | 200 μL | 1mL |
| 10623-E | GTP(100mM) | 100 μL | 200 μL | 1mL |
| 10623-F | UTP(100mM) | 100 μL | 200 μL | 1mL |
| 10623-G | 대조군 DNA 템플릿(500ng/μL) | 10 μL | 20 μL | 100 μL |
배송 및 보관
드라이아이스 운송. -15℃ ~ -25℃에 보관, 2년간 유효.
수치
그림 1. 표준 RNA는 T7 RNA 합성 키트를 사용하여 시험관 내에서 합성되었습니다.
반응물을 37°C의 PCR 기기에서 2시간 동안 배양한 후 자성 비드(Cat#12602)로 정제했습니다. 수율 결과는 그림 1과 같이 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 분석했습니다.
그림 2. T7 키트를 이용한 다양한 길이의 RNA 전사 증명(전기영동도(그림 2A), 모세관 전기영동도(그림 2B), 크로마토그램(그림 2C))
그림 3. 시험관 내에서 캡핑된 RNA 합성.
반응물을 PCR 기기에서 37°C에서 2시간 동안 배양한 후, 자성 비드(Cat#12602)로 정제했습니다. 수율 결과는 그림 3A와 같이 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 분석했습니다. 무결성 결과는 그림 3B와 같이 모세관 전기영동을 통해 분석했습니다.
1. 낮은 전사 수율
템플릿의 품질은 수율과 밀접한 관련이 있습니다. 실험군의 수율이 대조군보다 유의미하게 낮은 경우, 그 이유는 다음과 같습니다.
① 실험 템플릿에는 억제 성분이 포함되어 있습니다.
② 템플릿에 문제가 있습니다.
제안:
① 템플릿을 재정제합니다.
② 템플릿 정량화 및 무결성을 확인합니다.
③ 반응시간을 늘리세요.
④ 템플릿 입력량을 늘려주세요.
⑤ 다른 프로모터와 RNA 중합효소를 시도해 보세요.
2. 짧은 전사본의 수율이 낮음
짧은 전사 개시 단편은 반응을 저해합니다. 전사 산물이 100 nt 미만인 경우, 반응 시간을 4~8시간으로 늘리거나 주형의 양을 2 μg으로 늘리면 RNA 수율이 증가합니다.
3. RNA 전사 길이가 예상보다 길다
전기영동 결과 제품 밴드가 예상 크기보다 큰 것으로 나타나면 다음과 같은 이유가 있을 수 있습니다.
①플라스미드 템플릿은 완전히 선형화되지 않을 수 있습니다.
② 센스 가닥의 3' 말단은 눈에 띄는 구조를 가지고 있습니다.
③RNA는 완전히 변성되지 않은 2차 구조를 가지고 있습니다.
제안:
①템플릿이 완전히 선형화되었는지 확인하고, 필요한 경우 추가 선형화를 수행합니다.
②3' 오버행을 피하기 위해 적절한 제한 효소를 선택하거나 Klenow Fragment/T4 DNA polymerase를 사용하여 전사를 완료한 후 진행합니다.
③ 변성 젤을 사용하여 RNA 생성물을 검출합니다.
4. RNA 전사 길이가 예상보다 짧습니다.
전기영동 결과 제품 밴드가 예상 크기보다 작은 경우 다음과 같은 이유가 있을 수 있습니다.
①템플릿에는 T7 RNA 중합효소와 유사한 종결 서열이 포함되어 있습니다.
②템플릿의 GC 함량이 높다.
제안:
① 반응 온도를 낮추세요(예: 30°C). 온도를 낮추면 전사 길이는 증가하지만 수율은 감소합니다. 또는 다른 RNA 중합효소를 사용하여 전사를 시도해 보세요.
②템플릿 GC 함량이 높을 경우 42℃에서 전사하거나 SSB를 첨가하여 수율과 전사 길이를 늘린다.
5. 전사산물의 전기영동 테일링
전기영동 중에는 테일링 현상이 발생합니다.
가능한 이유:
①실험 수행 중 RNase에 의해 오염됨
②RNase에 의한 DNA 템플릿 오염.
제안:
① RNase가 없는 피펫 팁과 EP 튜브를 사용하고, 일회용 라텍스 장갑과 마스크를 착용하며, 모든 시약은 RNase가 없는 H2O로 준비합니다.
②템플릿 DNA를 다시 정제합니다.
[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al. Nosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8)은 숙주 Bombyx mori에서 BmPEX16 유전자 발현을 조절하여 곰팡이 병원성을 증가시킨다. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X, Tang S, Ye S 외. 삼중 가닥 치환 증폭 캐스케이드를 이용한 순환 miR-195-5p의 초고감도 정량. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
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