추상적인:
세포골격은 주로 미세섬유, 미세소관, 그리고 중간섬유로 구성됩니다. 미세섬유는 주로 액틴으로 구성되어 있으며, 구형 단량체 G-액틴과 필라멘트 형태의 F-액틴으로 존재합니다. 미세섬유의 조립은 G-액틴을 F-액틴으로 중합하는 과정을 포함합니다. 광대버섯(Amanita phalloides)에서 분리된 고리형 펩타이드인 팔로이딘은 높은 특이성과 친화도로 F-액틴에 결합하므로 세포 미세섬유 염색에 널리 사용됩니다.
성공적인 염색을 위해서는 적절한 팔로이딘 제품 선택, 정확한 고정 및 투과성, 그리고 적절한 작업 농도 및 배양 조건이 매우 중요합니다. 팔로이딘을 사용하여 세포골격을 염색할 때 자주 발생하는 실패 요인을 아래에서 살펴보겠습니다.
Q1: 고정하지 않고도 샘플을 사용할 수 있나요?
아니요. 형광성 팔로이딘 접합체는 크기와 화학적 특성으로 인해 세포막을 통과할 수 없으므로 고정 및 투과성 조절이 필수적입니다.
Q2: 어떤 고정제를 사용해야 합니까?
F-액틴 염색에는 파라포름알데히드(PFA)가 필수적입니다. PFA는 단백질 구조를 파괴하는 메탄올과 달리 4차 구조를 보존합니다. 권장: 4% PFA, 실온에서 10분. 글루타르알데히드 고정도 가능합니다. 시험된 고정제(예: H1299 세포) 중 TRITC-Phalloidin을 사용한 경우 4% PFA가 가장 선명한 미세섬유 구조를 나타냈습니다.
Q3: 투과성이 필요한가요?
네. 고정 후 투과성 확보가 중요합니다. 권장: 0.1% Triton X100을 실온에서 5분간 처리합니다.
Q4: 작업 농도와 배양 시간은 어떻습니까?
다음에 따라 달라집니다:
형광단 접합체의 종류와 스톡 농도. 표지되지 않은 팔로이딘의 Kd는 약 36 nM이고, 표지된 팔로이딘의 Kd는 50 nM~20 µM입니다. 스톡 농도를 확인하세요.
세포 유형. 일반적으로 80~200 nM이 사용되며, 100 nM이 일반적입니다. 특정 세포(예: 혈소판, 치수줄기세포, 파골세포)에는 5~10 µM이 필요할 수 있습니다.
기본 배양 시간은 30분입니다. 신호가 약하면 4°C에서 하룻밤 배양하거나 온도를 조절할 수 있습니다.
Q5: 형광체 접합체는 어떻게 선택해야 하나요?
FITC와 TRITC 팔로이딘은 신뢰할 수 있는 고전적 지표입니다.
다중화의 경우 다른 항체와 겹치지 않는 염료를 선택하세요.
높은 밝기와 광안정성을 원하신다면 Alexa Fluor 또는 iFluor 시리즈를 고려해 보세요.
Q6: 팔로이딘을 조직 절편에 사용할 수 있나요?
네, 단서가 있습니다. 파라핀 포매 용매와 왁스는 결합을 방해할 수 있으며, 파라핀 제거 후에도 구조적 변화로 인해 염색 품질이 저하되는 경우가 많습니다. 조직 염색 순위: 세포 > 동결 절편 > 파라핀.
Q7: 형태학적 변이는 정상인가요?
네. F-액틴 배열은 세포 주기에 따라 변합니다. 예를 들어, 유사분열 중인 스위스 3T3 세포는 간기 세포와 비교하여 다른 F-액틴 형태를 보입니다.
Q8: 단백질이나 핵을 염색할 때(예: DAPI를 사용하여) 권장되는 염색 순서는 무엇입니까?
고정 및 투과화 후, 먼저 표적 단백질에 대한 면역염색을 수행하고, 미세섬유를 형광 팔로이딘으로 염색한 후, 마지막으로 핵을 DAPI로 염색합니다. DAPI와 팔로이딘은 PBS에서 간섭 없이 동시 배양할 수 있습니다.
적절한 시약과 방법을 사용하면 염색 효율이 크게 향상됩니다. 모두 아름다운 세포골격 이미지를 얻으시길 바랍니다!
참고문헌:
Luo Guo, Bao Yuxin, Li Jin. 세포골격 형광 염색에 대한 다양한 고정제의 영향 [J]. 제3군의학대학 저널 , 2011, 33(7):753755.
Anderson MT, Sherrard K, Horne-Badovinac S. 집단적으로 이동하는 난포 세포에서 기저부에 국소화된 F-액틴 네트워크의 최적화된 고정 및 팔로이딘 염색. Giedt MS, Tootle TL, 편집. Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology , vol 2626. Humana, New York, NY, 2023.
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제품명 |
사양 |
카탈로그 번호 |
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300 T / 1 mg |
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